Иммуноферментный анализ презентация

Иммуноферментный анализ (ИФА) - относится к современным методам ИА и используется для качественного и количественного определения антигенов/ антител в биологических образцах. ИФА

Диагностика инфекционных и вирусных заболеваний (все инфекции, ВИЧ, гепатиты) - выявление АГ и/или специфических АТ к ним; Диагностика инфекционных и вирусных заболеваний (все инфекции, ВИЧ, гепатиты) - выявление АГ и/или специфических АТ к ним; Кардиомаркеры (hs СРБ, тропонин, миоглобин, NTproBNP); Определение уровня гормонов (щитовидной железы, надпочечников, половые и т.д.); Выявление и определение уровня ксенобиотиков (лекарственных препаратов, токсикантов, наркотических веществ); Определение уровня иммуноглобулинов (Ig A, М,G, Е, подклассы IgG 1-4); Определение уровня цитокинов (все IL,интерфероны, ФНО, КСФ и т.д.); Выявление иммунных комплексов; Определение уровня опухолевых маркеров (ОМ); Определение уровня специфических белков крови (ферритин, TRF, фибронектин , эритропоэтин и др.); Определение концентрации ферментов (СОД, глутатионпероксидаза, каталаза и т.д.); Скрининг моноклональных антител; Определение компонентов костного метаболизма (маркеров остеосинтеза и резорбции – (ДПД, С-концевые телопептиды, остеокальцин и т.д.) Определение факторов свертывания крови (Д-димер)

Области применения ИФА Иммунология; Инфекционные и вирусные заболевания; Кардиология; Патология гемостаза; Онкология; Фертильность и репродукция; Гормоны; Ветеринария

2. По количеству этапов в постановке реакций ИФА: 2. По количеству этапов в постановке реакций ИФА: прямой; непрямой 3. По количеству реагентов на первом этапе: конкурентный неконкурентный

ИФА типа «сэндвич»

Конкурентный ИФА первом этапе анализа два реагента (for example биологическая проба и коньюгат)

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИФА

ПРОТОКОЛ ИФА

Гемостаз - биологическая система, функция которой заключается в сохранении жидкого состояния крови, остановке кровотечений при повреждениях стенок сосудов и растворении тромбов, выполнивших свою функцию в процессе свертывания крови. Гемостаз - биологическая система, функция которой заключается в сохранении жидкого состояния крови, остановке кровотечений при повреждениях стенок сосудов и растворении тромбов, выполнивших свою функцию в процессе свертывания крови. Свертывание крови – сложная цепь реакций, в которых участвуют сосудистая стенка, тромбоциты и факторы свертывания.

Ферментативная теория свертывания (1902 г. Александр Шмидт (Россия)

Современная схема свертывания крови (5 фаз) – 5-6 мин 1. Образование протромбиназ (тканевой + кровяной) - 3-4 мин; 2. Образование тромбина; 3. Образование фибрина; 4. Полимеризация фибрина и организация сгустка; 5. Фибринолиз - лизис фибринового сгустка, который приводит к растворению тромба после репарации поврежденной стенки сосуда. .

Современная схема свертывания крови Современная схема свертывания крови

Факторы свертывания крови Факторы свёртывания крови — группа веществ, содержащихся в плазме крови и тромбоцитах, обеспечивающих свёртывание крови: Плазменные (17 ф.) - I - XIII; Тромбоцитарные (14-22 ф.); Тканевые факторы; Клеточные (эритроциты, лейкоциты) Плазменные факторы свертывания преимущественно синтезируются в печени. Ф. VIII – в клетках эндотелия Большинство факторов свёртывания — белки (ферменты, кофакторы ферментов, ингибиторы ферментов). Ca 2+ и др. низкомолекулярные органические вещества. В норме белковые факторы свёртывания крови находятся в плазме в неактивном состоянии. В процессе свертывания крови предшественники факторов свертывания превращаются в их активные формы.

Классификация факторов свертывания I: Субстраты (фибриноген (I); Ферменты – большинство Кофакторы ферментов (тканевой фактор, факторы V VIII, фактор Фицджеральда); II: Группа ф/г (I, V, VIII, XIII); Группа протромбина (II, VII, IX, X); Контактные факторы (XI, XII, прекалликреин, кининоген)

Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз - спазм сосудов и их механическая закупорка агрегатами тромбоцитов. Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз - спазм сосудов и их механическая закупорка агрегатами тромбоцитов. Механизм: адгезия, активация и агрегация тромбоцитов на обнажившихся в результате повреждения коллагеновых волокнах сосудистой стенки. В результате образуется «белый тромб» (тромб с преобладанием тромбоцитов.

Роль сосудов в остановке кровотечения Вазоконстрикция (сужение просвета сосуда) осуществляется под влиянием БАВ тромбоцитов (серотонин, тромбоксан) приводит к: - сокращению кровотока через поврежденный участок; - стимуляции агрегации тромбоцитов; - контактной активации свертывания с дальнейшим запуском ферментативных реакций вторичного гемостаза (плазменного)

Длительность кровотечения по Дуке

Современная схема свертывания крови Современная схема свертывания крови

СВЕРТЫВАНИЕ КРОВИ IN VITRO - МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГЕМОСТАЗА Протромбиновое время (ПВ) Активированное парциальное (частичное) тромбопластиновое время (АЧТВ) Тромбиновое время Фибриноген Продукты деградации фибрина (ПДФ) Д-димер

Протромбиновое время (ПВ), А. Квик, 1935г. ПВ в норме 12-17 сек; 2) Протромбиновое отношение (ПО) ПО = ПВ пациента/ПВ контрольной плазмы (в норме 0,9-1,3); 3) Протромбин (по Квику) – определяется по калибровочному графику, построенному на нормальной плазме; 4) Международное нормализированное отношение (МНО) = (ПВ пациента/ПВ контроля x МИЧ* Референсное значение 0,9-1,3 *МИЧ – международный индекс чувствительности

ПВ оценивает внешний механизм свертывания укорачивается при активации внешнего механизма свертывания (травмы, хирургические вмешательства, атеросклероз, инфекции); удлиняется: – дефицит или аномалия факторов протромбинового комплекса (VII, X, V, II); - прием непрямых антикоагулянтов (варфарин); - болезни печени; - дефицит витамина К; - ДВС в фазе гипокоагуляции

АЧТВ – оценивает внутренний механизм свертывания Норма АЧТВ от 28 до 38 сек Укорочение АЧТВ: - при активации внутреннего механизма свертывания (тромбозы) - ДВС (фаза гиперкоагуляции). Удлинение: – дефицит факторов внутреннего пути свертывания (VIII, IX, XI, XII) если результаты ПВ являются нормальными; дефицит II, V, X при гипокоагуляции по результатам ПВ; дефицит фактора Виллебранда; ДВС (фаза гипокоагуляции) заболевания печени дефицит витамина К

D-димер - продукт деградации фибрина при воздействии на него плазмина. Концентрация D-димера пропорциональна активности фибринолиза (количеству лизируемого фибрина). Методы определения: Одностадийный ИФА. Специфичность анализа обеспечивается использованием моноклональных антител, обладающих высокой специфичностью к D-димеру. Нормальная концентрация D-димера в крови 0 - 250 нг/мл.

Программа по профилактике и лечению лиц ГПР по ЖДА (из рекомендаций ценрта по Контролю заболеваемости США, 1998) Дети грудного (0-12 мес.) и младшего (1-5 лет) возраста: Грудное вскармливание или питательные смеси обогащенные Fe; прикорм в виде фруктов, овощей и соков по достижению 6-месячного возраста; Обследование для выявление анемии каждые 6 месяцев. Дети младшего школьного возраста (5-12 лет) и мальчики-подростки (12-18 лет): Обследование детей с ЖДА или недостаточным потреблением Fe в анамнезе; Девочки-подростки (12-18 лет) и женщины детородного возраста вне периода беременности: Потребление богатой Fe пищи и продуктов, усиливающих его всасывание; Обследование каждые 5-10 лет на протяжении всего детородного периода;

Период беременности: Период беременности: Назначение пероральных препаратов Fe при первом посещении женской консультации; Обследование на анемию при первом посещении женской консультации; При уровне Hg < 90 г/л обеспечить последующее наблюдение; Послеродовой период: Факторы риска включают длительную анемию, большую кровопотерю и многоплодную беременность; Мужчины старше 18 лет и женщины в постменопаузе: Плановое обследование не показано.

Группы особого риска по ЖДА беременных и кормящих грудью - до 70-80%; дети в возрасте до 1 года - до 45%.

Fe -содержащие белки и их функции в организме транспорт O2 и СО2- (гемоглобин, миоглобин); окислительно-восстановительные реакции (цитохромы, пероксидаза, каталаза); транспорт и депонирование железа (трансферрин, ферритин, гемосидерин)

28-31 мг/кг – в составе Hg; 28-31 мг/кг – в составе Hg; 4-5 мг/кг – в составе миоглобина; 12 мг/кг – ферритина и гемосидерина; Остальное – в составе гемсодержащих и др. ферментов.

Содержание Fe в различных органах

Трансферрин – транспортный белок (88 кДа), синтезируется в печени, молекула содержит два центра связывания (2 атома Fe2+). Трансферрин – транспортный белок (88 кДа), синтезируется в печени, молекула содержит два центра связывания (2 атома Fe2+). Биологическая роль – связывает и переносит Fe в эритрокариоциты костного мозга или в органы-депо Fe (печень и т.д.) Ферритин – высокомолекулярный водорастворимый белок (500 кДа), содержит 20% Fe3+. Содержится практически во всех клетках организма, в большей степени - в селезенке, печени, костном мозге. Биологическая роль – депо Fe. Гемосидерин - небелковый комплекс нерастворимым в H2O и очень богатый Fe (37%). Содержится главным образом в макрофагах РЭС печени и селезенки. Биологическая роль – изучена недостаточно.

БАЛАНС Fe в организме определяется: Поступлением железа в организм с продуктами питания; Всасыванием железа в органах ЖКТ; Эритропоэзом; Депонированием железа; Потерями железа.

Выделение (потери) Fe из организма из ЖКТ (кал, желчь, слущивающийся эпителий кишки) - 0,6-0,7 мг/сутки; через почки - до 0,1 мг/сутки; менструации у женщин - от 0,6-1,2 мг до 2,5 мг железа /сутки. Всего за цикл 2 - 79 мг; выделение через кожу (пот) - 0,2-0,3 мг/сутки Нерегулярные потери - беременность и лактация.

Лабораторные показатели, характеризующие обмен Fe Сывороточное Fe; ОЖСС (общая Fe-связывающая способность сыворотки) - максимальное количество Fe, которое может присоединить трансферрин (TRF); коэффициент насыщения TRF = сыв. Fe/ ОЖСС; Концентрация ферритина; Концентрация трансферрина.

Снижение уровня сывороточного Fe При железодефицитной анемии (ЖДА); при анемиях, связанных с воспалением, острыми инфекциями; при заболеваниях органов ЖКТ; Опухолях; Инфаркте миокарда

Критерии ВОЗ для диагностики анемии Эритроциты <4,0 x109/л, Hg <130,0 г/л, гематокрит <39%. Эритроциты <3,8 x109/л, Hg <120,0 г/л, гематокрит <36%.

Железодефицитная анемия (ЖДА) – это анемии, обусловленные нарушением синтеза Hb и соответственно снижением его количества в единице объема крови. Непосредственной причиной является дефицит Fe в организме.

Причины железодефицитной анемии Кровопотери (различного происхождения) Врожденный дефицит белка трансферрина; Анемия у детей Донорство Нарушение всасывания железа (хронический энтерит, резекция 12-перстной кишки и желудка)

Группы особого риска по ЖДА беременных и кормящих грудью - до 70-80%; дети в возрасте до 1 года - до 45%.

Стадии формирования ЖДА стадия - скрытый (латентный) дефицит железа; стадия проявлений ЖДА (синдром анемии).

I стадия ЖДА. Лабораторные показатели на стадии латентного дефицита Fe 1.Общий анализ крови (ОАК) Hb>120 г/л RBC, MCV, MCH, MCHC, RDW – НОРМА 2. Обмен железа: СЫВОРОТОЧНОЕ ЖЕЛЕЗО - НОРМА ИЛИ СНИЖЕНО, ТРАНСФЕРРИН - НОРМА ФЕРРИТИН – СНИЖЕН

II стадия ЖДА. Лабораторные показатели на стадии клинических проявлений ЖДА ОАК: Hb (гемоглобин) - < 120 г/л RBC (эритроциты) - норма или снижены; MCV (средний объем эритроцитов) - менее 80 fl; MCH - менее 26 пг; MCHC - менее 320 г/л; RDW - > нормы. Норма 11,5-14,5%.

Диагностика ЖДА по эритроцитарным индексам

ПОКАЗАТЕЛИ ОБМЕНА ЖЕЛЕЗА (БИОХИМИЧЕСКИЕ) Уровень сывороточного Fe - снижен; Уровень ферритина – резко снижен; ОЖСС - повышена; Коэффициент насыщения трансферрина - снижен