Сельскохозяйственная биотехнология как основа повышения урожайности растений и продуктивности животных и птиц презентация

Фитобиотехнология – использование биотехнологических методов в растениеводстве

Этапы развития фитобиотехнологии: I период – 1892-1922 гг. нем. Фехтинг, Рехингер и Габерландт – первые попытки выращивания каллусной ткани; выдвинута теория полярности органов растений и отдельных клеток; теория о тотипотентности растительных клеток.

II период – 1922-1939 гг. – Уайт, Готре и др. продемонстрирована способность к неограниченному росту in vitro изолированных растительных клеток; совершенствование питательных сред

III период – 1940 – 1960 гг. –изучено значение микро-и макроэлементов для поддержания нормальной ростовой активности растительной ткани; выявлена потребность в витаминах и стимуляторах роста; открыт класс фитогормонов – цитокинины.

IV период – 1960 -1975 гг. – предложен метод получения изолированных протопластов путем обработки растительных клеток смесью пектолитических и целлюлолитических ферментов, а так же найдены условия их культивирования, при которых они образуют новую клеточную стенку, делятся и дают начало новым клеточным линиям; разработан метод гибридизации соматических клеток при обработке полиэтиленгликолем (ПЭГ) и введением в них вирусных РНК, клеточных органелл, клеток бактерий;

V период – с 1976 г – разработан метод электрослияния изолированных протопластов и методы селекции гибридных клеток, разработан способ переноса генов для двудольных растений на основе Ti- плазмиды Agrobacterium tumefaciens, предложен метод биобаллистической трансформации

Направления генетической модификации растений: Получение с/х культур с более высокой урожайностью; Получение с/х культур, дающих несколько урожаев в год; Создание сортов с/х культур, токсичных для некоторых видов вредителей (картофель, листья которого содержат протоксин для колорадского жука);

Создание с/х культур, устойчивых к неблагоприятным климатическим условиям (трансгенные растения, устойчивые к засухе – несут ген скорпиона); Создание с/х культур, устойчивых к неблагоприятным климатическим условиям (трансгенные растения, устойчивые к засухе – несут ген скорпиона); Создание сортов растений, способных синтезировать белки животного происхождения ( табак, синтезирующий лактоферрин человека).

Этапы получения трансгенных растений: Выбор гена и его клонирование –определяется необходимостью передачи растению определенного хозяйственно-полезного признака (большинство генов выделены из бактериальных геномов, диких видов растений, реже из геномов насекомых или животных); Подбор генотипа растения-реципиента. В идеале подбирают растения, имеющие только одно отрицательное свойство (слабая устойчивость к засухе) ;

Введение гена и его экспрессия в геноме растения-реципиента. Для введения гена применяют трансформацию с помощью векторов, а также методы прямого переноса генов в геном растительных клеток. Введение гена и его экспрессия в геноме растения-реципиента. Для введения гена применяют трансформацию с помощью векторов, а также методы прямого переноса генов в геном растительных клеток. Регенерация трансформированных растительных клеток и отбор трансгенных растений. Зависит от тотипотентности клеток – способность регенерации фертильного растения (способного завязывать семена) из недифференцированных соматических клеток. Тотипотентность наиболее выражена у двудольных растений(картофель, свекла, рапс, томаты, морковь, капуста) , у однодольных (рис, кукуруза, пшеница)- слабее. Отбор модифицированных растительных клеток проводят на селективных средах, содержащих гербициды.

Трансформация растений с помощью агробактерий

Структура Ti-плазмиды

Сигналами, обеспечивающими перенос и стабильную интеграцию генов в ядерную ДНК растений является vir-область (область вирулентности) Ti-плазмид. Сигналами, обеспечивающими перенос и стабильную интеграцию генов в ядерную ДНК растений является vir-область (область вирулентности) Ti-плазмид. Vir-область состоит из семи локусов: vir-А, vir-B, vir-C, vir-D, vir-E, vir-G, vir-F. В определенной последовательности белковые продукты этих генов приводят к вырезанию Т-ДНК из состава Ti-плазмиды и встраиванию ее в растительный геном. Vir-область является обязательной частью вектора.

Идеальная векторная система на основе Ti-плазмиды должна включать: Сигналы, необходимые для переноса и стабильной интеграции в ядерную ДНК растений; Систему для экспрессии чужеродных генов в растениях (узнаваемый растительными полимеразами промотор); Маркер, необходимый для селекции трансформированных клеток Не содержать онкогенов, подавляющих дифференцировку растительных клеток

В качестве промотора для экспрессии (функционирования) чужеродных генов в геноме растения наиболее часто используют промотор 35S-РНК вируса мозаики цветной капусты (СаМV), обеспечивающий постоянную сильную экспрессию чужеродного гена, находящегося под его регуляцией, во всех тканях трансгенного растения. В качестве промотора для экспрессии (функционирования) чужеродных генов в геноме растения наиболее часто используют промотор 35S-РНК вируса мозаики цветной капусты (СаМV), обеспечивающий постоянную сильную экспрессию чужеродного гена, находящегося под его регуляцией, во всех тканях трансгенного растения.

В векторе обязательно должны быть предусмотрены гены-маркеры (репортерные гены), на основе которых проводят отбор модифицированных растений. В векторе обязательно должны быть предусмотрены гены-маркеры (репортерные гены), на основе которых проводят отбор модифицированных растений. Например LuxA и LuxB – это гены, выделенные из ДНК светлячков, контролирующие синтез люциферазы, которая обеспечивает переход люциферинов из окисленной формы в основную, что обеспечивает свечение модифицированного растения. Наиболее часто в качестве генов маркеров используют гены устойчивости к гербицидам (хлорсульфорону или фосфинотрицину).

Т-сегмент вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в плазмиду E.coli (pBR322), которая способна к многократной саморепликации, что приводит к увеличению числа копий участков Ti-плазмиды (клонирование); Т-сегмент вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в плазмиду E.coli (pBR322), которая способна к многократной саморепликации, что приводит к увеличению числа копий участков Ti-плазмиды (клонирование); В Т-сегмент встраивают определенный ген и снова размножают в E.coli; Выделяют гибридные плазмиды, а затем вводят в A.tumefaciens, несущие полную Ti-плазмиду. В результате обмена идентичными участками (гомологичная рекомбинация), происходит встраивание сконструированных Т-сегментов в нативные Ti-плазмиды, в результате чего получают Ti-плазмиды со встроенным в Т-сегмент чужеродным геном; Заражают растения модифицированными агробактериями. Клетки полученных трансгенных растений будут содержать интегрированную Т-ДНК со встроенным чужеродным геном.

Метод трансформации растительных клеток путем кокультивации с агробактерией Применяется для двудольных растений (эффективность до 60%). В качестве эксплантов для трансформации используются стерильные листовые диски, корешки, семядоли, междоузлия. Экспланты инокулируют жидкой средой, содержащей агробактерию с векторной конструкцией. После 24-48 часов кокультивирования в некоторых клетках происходит встраивание в растительный геном Т-ДНК с чужеродным геном. Экспланты переносят на среду, содержащую антибиотик (для подавления агробактерий) и гербициды для селективного отбора трансформированных клеток. Через 2-5 недель на трансформированном экспланте развиваются побеги модифицированных растений.

Методы прямого переноса генов (перенос осуществляется в протопласты растительных клеток) Микроинъекция ДНК – аналогично микроинъекциям в животные клетки (эффективность 10-15%); Электропорация – на протопласты, находящиеся в растворе, содержащем ДНК-векторы действуют высоковольтными импульсами (напряжение 200-350 В). При этом обратимо образуются поры в мембране, через которые клетки поглощают молекулы ДНК; Биобаллистическая трансформация - растительные клетки помещают в чашку Петри и выстреливают по ним из вакуумной пушки потоком мельчайших частичек вольфрама, платины или золота (d – 0,4 -1,2 мкм) с напылёнными на них молекулами ДНК.

Получение трансгенных растений: а-метод биобаллистики; б-кокультивация с агробактерией

Доказательство трансформации растительных клеток Проводят выявлением генов-маркеров (например генов устойчивости к антибиотикам канамицину (nptII) или гигромицину (hptII) и др.) С использованием ПЦР (полимеразно-цепной реакции) и молекулярного анализа; На основании блот-гибридизации хромосомной ДНК трансгенного растения с использованием в качестве радиоактивного зонда фрагмента Т-ДНК.

Возможные негативные эффекты использования генетически-модифицированного сырья В настоящее время методы генной инженерии технически несовершенны, исследователи не в состоянии управлять процессом встраивания нового гена и возникающие впоследствии эффекты его проявления; В результате искусственного добавления чужеродного гена непредвиденно могут образоваться опасные вещества (токсины, аллергены и т.д.); Не существует совершенно надежных методов проверки полученных растений на безвредность (более 10% серьезных побочных эффектов новых лекарств невозможно выявить, несмотря на тщательные исследования);

Знания о действии на окружающую среду модифици-рованных организмов недостаточны. Имеется множество возможностей для неконтролируемого распространения потенциально опасных генов, в том числе и передача генов бактериями и вирусами; Знания о действии на окружающую среду модифици-рованных организмов недостаточны. Имеется множество возможностей для неконтролируемого распространения потенциально опасных генов, в том числе и передача генов бактериями и вирусами; Знания о наследственном носителе ДНК – очень неполны. На настоящее время известно о функции лишь трех процентов ДНК. Рискованно манипулиро-вать сложными системами, знания о которых непол-ны. Обширный опыт в области биологии, экологии и медицины показывает, что модификация организмов может вызвать серьезные непредсказуемые проблемы.

Доение трансгенной мыши

Применение трансгенных животных Трансгенные животные – биореакторы Модели наследственных болезней Источник органов для пересадки человеку Получение гормона роста Повышение количества и качества продукции сельскохозяйственных животных Получение животных, устойчивых к различным заболеваниям

Методика создания химер выделяют яйцеклетки из доноров с различающимися генотипами; культивируют эмбрионы на стандартных питательных средах (основа-солевой буфер, ПВК и лактат, глюкоза, альбумин) до стадии 8 бластомеров; агрегируют морулы (8-кл.) (агрегационный метод) и культивируют in vitro до стадии бластоцисты; имплантируют химерный эмбрион в матку самки-рецепиента