Активированные кислородные метаболиты презентация

Активированные кислородные метаболиты (АКМ) Классификация, пути образования АКМ в организме

Синглетный кислород (1О2 ): пути образования, биологические эффекты

Пути образования супероксидного анион-радикала 1) Аутоокисление биомолекул (гемоглобина, тиоловых соединений, катехоламинов, биоптеринов). 2) Окислительно-восстановительные реакции, катализируемые металлофлавопротеинами (ксантиноксидоредуктаза, оксидазы аминокислот). 3) Электрон-транспортные цепи: а)митохондрий, б)микросом. 4) НАДФН-оксидаза 5) Арахидоновый каскад

Окислительно-восстановительные реакции, катализируемые металлофлавопротеинами. Ксантиноксидоредуктаза (КОР) – это группа из двух близких по структуре Mo6+ - и Fe2+ - содержащих изоферментов (КД↔КО) класса оксидоредуктаз

Схема катаболизма пуринов, катализируемого ксантиноксидоредуктазой

Схема функционирования ксантиноксидоредуктазы

Структура КОР КО – гомодимер, молекулярная масса субъединицы 150 кДа, а димера – 300 кДа. Каждая субъединица содержит 3 домена, связанные со специфическими кофакторами. N-концевой домен содержит два Fe2S2 центра, связанные с четырьмя остатками цистеина. Промежуточный домен содержит карман для ФАД, а С-концевой домен имеет молибденовый кофактор в форме молибденоптерина. В состав КОР в расчёте на каждый мономер входит также одна надсульфидная группа ( — S — SH), которая, возможно, и служит для связывания молибдена. При этом птерин и надсульфидная группа не принимают непосредственного участия в каталитическом акте. Белковая часть фермента богата цистеином и содержит 60–62 свободные SH-группы. Ксантин и гипоксантин окисляются на Мо-фрагменте, где Мо6+ восстанавливается до Мо4+, затем электроны через Fe2S2 центры переносятся на ФАД, а с ФАД-фрагмента на НАД+ или О2, в зависимости от изоформы.

Схема синтеза NO и ONOOH под действием КОР

Регуляция активности КОР Индукторы КОР: интерферон молибдат Активаторы КОР: аскорбат глутатион дитиотреитол Конкурентные ингибиторы КОР: вольфрамат аллопуринол 6-меркаптопурин кофеин

Аллопуринол является неселективным ингибитором КОР, под действием которой аллопуринол превращается в оксипуринол, неокисляемый аналог ксантина.

Сравнение ингибирующего действия аллопуринола и фебуксостата

Биологическая роль ксантиноксидоредуктазы 1 Генерация АКМ посредством КО-реакции играет важную роль при различных процессах: - метаболизме железа; - регуляции тонуса сосудов; - клеточной пролиферации; - апоптозе; - обеспечении бактерицидного потенциала молока. 2) Антимикробная роль КОР в обеспечении врожденного иммунитета 3) Антиоксидантная роль (источник мочевой кислоты) 4) КО – молекулярный переключатель, регулирующий тонус сосудов и адгезию лейкоцитов к эндотелию. 5) Супероксид, образующийся в КО-реакции, предшественник других форм АКМ.

ЭТЦ митохондрий – источник АФК. Два лика митохондрий как «силовых станций клетки» и важнейших продуцентов АФК

Роль ЭТЦ митохондрий в образовании супероксидного анион-радикала

Сайты генерации супероксида в ЭТЦ митохондрий (открыто 9 сайтов). Внешняя мембрана: - редуктаза цитохрома b5 - моноаминооксидазы А и Б Внутренняя мембрана - дегидрогеназа альфа-глицерофосфата - сукцинатдегидрогеназа (комплекс II) - комплекс I (НАДН-убихинон-оксидоредуктаза) - комплекс III (убихинон: цитохром с - редуктаза)

Продукция АФК в ЭТЦ митохондрий

Роль митохондрий в индукции апоптоза. Открытие апоптоз-индуцирующегл фактора (AIF ) Гвидо Крэмером (1994)

Митоходриальный (внутренний) путь апоптоза

Образование митоптического тельца и митоптоз

Роль ЭТЦ митохондрий в развитии нейродегенеративных заболеваний – болезни Паркинсона (PD), бокового амиотрофического склероза (ALS), болезни Гентингтона (HD), болезни Альцгеймера (AD)

Болезнь Паркинсона – впервые описана Джеймсом Паркинсоном в  1817  году в «Эссе о дрожжательном параличе». Основу клинической картины БП составляет классическая триада: акинезия (гипокинезия), мышечная ригидность и тремор покоя.

Механизмы болезни Альцгеймера

Боковой амиотрофический склероз (болезнь Лу Герига, болезнь мотонейронов, нарушение II и IV ФК ЭТЦ)

Митохондриально-направленная терапия нейродегенеративных заболеваний

Значение АКМ, образующихся в системе микросомального окисления Продукция АКМ монооксигеназами имеет значение для: регуляции тонуса сосудов; синтеза медиаторов и регуляторов при воспалении или ишемии/реперфузии; свободно-радикального повреждения гепатоцитов и развития цирроза печени при алкоголизме; гепатотоксического действия лекарственных препаратов (парацетамола, диклофенака, галотана, вальпроевой кислоты и др.).

Структура НАДФН-оксидазы. Состоит из 6 гетерогенных субъединиц: 2 мембрано-связанных (gp 91, p 22) и 4 цитозольных (p47, p40, р67, Rac), которые под влиянием стимуляторов объединяются в ферментативный комплекс, генерирующий О2‾•. 2) Важнейший компонент НАДФН-оксидазы – цитохром b558 состоит из гликопротеина - -субъединицы (gp91) и α-субъединицы (р22). -субъединица (gp91) содержит 6 трансмембранных α-спиралей на N-конце и участки гликозилирования. С-конец имеет сайты связывания ФАД и НАДФН, в состав цит b558 входит 2 гема

Модель флавоцитохрома b558 НАДФН → ФАД → ФАДН• → гем(внутр) → гем(внеш) → О2 → О2‾•.

Роль НАДФН-оксидазы в патогенезе заболеваний. Хронический гранулематоз («детский фатальный хронический гранулематоз»; 1:200-250 тыс.) – генетические дефекты субъединиц НАДФН-оксидазы, невозможность развития дыхательного взрыва лейкоцитов. Лимфогранулематоз (болезнь Ходжкина, злокачествен-ная гранулема) – злокачественное заболевание лимфоидной ткани, характерным признаком которого является наличие гигантских клеток Березовского-Штернберга и ингибирование НАДФН-оксидазы.

Арахидоновый каскад – источник АФК

Синтез эйкозаноидов из арахидоновой кислоты

Эйкозаноиды В середине 30-х годов 20 века шведский ученый Эйлер (V. Euler) обнаружил в экстракте из предстательной железы (простаты) биологически активные вещества, которые он назвал простагландинами (PG), полагая, что они присутствуют только в предстательной железе. Позже было установлено, что простагландины образуются практически во всех органах и тканях. В 1962 г. была расшифрована химическая структура простагландинов. Простагландины вместе с лейкотриенами и тромбоксанами составляют группу эйкозаноидов – биологически активных веществ, содержащих 20 атомов углерода (эйкоза по-гречески 20).

Функции эйкозаноидов Эйкозаноиды регулируют тонус гладкой мускулатуры, влияя на артериальное давление, состояние бронхов, кишечника, матки. Регулируют секрецию воды и натрия почками, влияют на свертывание крови. Регулируют состояние слизистой оболочки желудка. Участвуют в формировании процесса воспаления при повреждении тканей и инфекции (боль, отек, лихорадка). Избыточная секреция эйкозаноидов приводит к развитию таких заболеваний как бронхиальная астма и других аллергические реакций, а также к тромбозам. Недостаточная секреция эйкозаноидов приводит к возникновению язвы желудка.

Циклооксигеназный и липоксигеназный пути превращения полиеновых жирных кислот Синтез простагландинов начинается только после освобождения полиеновых кислот из фосфолипидов мембраны. Активация этого процесса происходит под действием гормонов, цитокинов, гистамина, механического воздействия После освобождения полиеновой кислоты в цитоплазму в зависимости от типа клеток происходит ее превращение в простагландины (циклооксигеназный путь) или в лейкотриены (липоксигеназный путь) Циклооксигеназный путь – включение в арахидоновую кислоту 4 атомов кислорода и формирование 5-членного кольца. Образуется нестабильное гидропероксипроизводное (PGG2), которое в результате действия пероксидазы превращается в PGH2 (восстановленная OH-группа у 15 атома углерода) Липоксигеназный путь начинается с присоединения к одному из атомов углерода у двойной связи молекулы кислорода с образованием гидропероксидов

Циклооксигеназа Циклооксигеназа (ЦОГ; простагландин G/H синтаза, КФ 1.14.99.1), катализирует первые 2 стадии синтеза простагландинов. Гомодимер из идентичных гликопротеинов (576 и 581 а.к.) с двумя активными центрами, обладающими разной ферментативной активностью. Катализирует включение в арахидоновую кислоту (АА) 4 атомов кислорода и формирование пятичленного кольца (образование нестабильного PGG2). Затем в PGG2 происходит восстановление гидропероксида у 15 атома углерода до гидроксильной группы (пероксидаза) с образованием стабильного PGH2. Локализована в ЭПР, каждая субъединица димера содержит три домена: домен фактора роста эпидермиса (34–72), мембранный домен (73–116) и каталитический домен с пероксидазным и циклооксигеназным активными центрами В активном центре циклооксигеназы – тирозин (Tyr385), в активном центре пероксидазы – гем. Гем находится на дне неглубокой щели. Благодаря такой структуре к гему имеют доступ многие гидрофильные соединения, препятствие обеспечивается небольшим кластером из нескольких гидрофобных аминокислот, формирующим купол над частью щели. Структура активного центра объясняет широкую субстратную специфичность пероксидазы ЦОГ, которая восстанавливает многие органические пероксиды.

Что такое простагландины? Простагландины – биологически активные вещества, являющиеся производными ненасыщенных жирных кислот, состоящие из 20 атомов углерода. Молекула простагландина содержит пятичленный цикл и две боковые цепи. Обычно в 15-м положении у них имеется гидроксильная группа.

Простациклины PGI

ТРОМБОКСАНЫ

Синтез простагландинов семейств 1, 2 и 3 из разных субстратов

Изоформы циклооксигеназы (ЦОГ-2 гипотеза)

Неспецифические ингибиторы ЦОГ Аспирин – необратимо ингибирует ЦОГ-1 и ЦОГ-2 за счет ацетилирования серина вблизи активного центра (Ser530) (J. Vein, 1971) Ибупрофен и ацетоминофен – конкурентные обратимые ингибиторы обеих изоформ ЦОГ Считают, что терапевтическое действие этих препаратов связано в основном с ингибированием ЦОГ-1. Однако ингибирование этой изоформы обеспечивает повреждение слизистой оболочки желудка (в США за счет этого 16500 смертей в год) Полуселективные ингибиторы – мелоксикам (мовалис)

Специфические ингибиторы изоформ ЦОГ Селективные ингибиторы ЦОГ-2 (вальдекоксиб, рофекоксиб, целекоксиб) были синтезированы для уменьшения токсического воздействия на желудочно-кишечный тракт. Селективность ингибиторов ЦОГ-2 увеличивается в ряду: рофекоксиб > валдекоксиб > парекоксиб > целекоксиб) Рофекоксиб был отозван фирмой Merk в связи с повышенным риском возникновения инфаркта миокарда и инсульта

Лейкотриены Характерная особенность лейкотриенов – отсутствие циклической структуры и наличие трех сопряженных связей (три-ен). Вырабатываются они в основном в полиморфноядерных лейкоцитах (5-липоксигеназа), хотя этот процесс происходит также в тромбоцитах (12-липоксигеназа) и эозинофилах (5-липоксигеназа). Выделяют типы лейкотриенов А, В, С, D и Е, в зависимости от количества двойных связей их делят на серии 3, 4 и 5.

Образование лейкотриенов

Функции лейкотриенов LTС4, LTD4, LTE4, клетки белой крови, альвеолярные макрофаги: расширение сосудов, увеличение их проницаемости, сокращение бронхов, основной «медленный компонент анафилактической реакции» LXA4, лейкоциты: активация хемотаксиса и образование супероксид аниона в лейкоцитах

Роль эйкозаноидов в развитиии воспаления Воспаление – реакция организма на повреждение или инфекцию, направленная на уничтожение инфекционного агента и восстановление поврежденных тканей. Продукция простагландинов, а также гистамина и кининов активируется каскадами реакций, запускаемых при внедрении инфекционных агентов Результат – увеличение проницаемости капилляров, перемещение лейкоцитов через сосудистую стенку (хемотаксис). Мощным фактором хемотаксиса является лейкотриен А4.

Биологические эффекты супероксида По оценкам Бэрри Холливелла, 1-3 % кислорода, поступающего при дыхании, преобразуется в О2.. в организме человека за год образуется 2 кг О2.. О2‾• может быть родоначальником других свободнорадикальных интермедиатов – Н2О2, •ОН; является важным компонентом неспецифической иммунной защиты; О2─• – новый внутриклеточный мессенджер, индуцирует образование пор в митохондриальной мембране и регулирует сопряжение окисления и фосфорилирования в ЭТЦ митохондрий; участвует в регуляции апоптоза; • модулирует экспрессию генов; регулирует клеточную пролиферацию; участвует в биотрансформации ксенобиотиков; • управляет процессом вазоконстрикции путем выключения сигнальной функции NO•; • участвует в метаболизме железа, О2─•. может повышать уровень Fe2+ путем мобилизации его из Fe-содержащих белков; О2─•, образующийся под контролем G-белков, регулирует хлорные каналы париетальных клеток желудка.  

Перекись водорода (Н2О2) Главные источники перекиси водорода в организме:

Эффекты Н2О2 в клетке. При концентрации больше 1 мМ Н2О2 проявляет цитотоксические эффекты: 1) Н2О2 – источник ОН-радикалов (р. Фентона, р. Габера-Вейса) 2) Н2О2 – субстрат ферментативных реакций образования гипогалогенитов (МПО, ЭПО, ЛПО) 3) Н2О2 в миллимолярных концентрациях вызывает гибель в культуре фибробластов, гепатоцитов, гладкомышечных клеток. 4) Н2О2 индуцирует апоптоз 5) Вызывает однонитевые разрывы ДНК 6) Вызывает деградацию гемовых белков и высвобождение Fe2+, cмесь Н2О2+ ВЭГ в плазме крови – биологический реактив Фентона 7) Отравление Н2О2 на уровне целого организма приводит к газовой эмболии

При концентрациях Н2О2 ниже 50 мкМ - регулятор физиологических функций и сигнальная молекула. НАДФН-оксидазный аппарат клеток создает в крови и межклеточной среде пул Н2О2. Эффекты малых доз Н2О2: 1) активация К+-каналов плазматической мембраны; 2) дозозависимое усиление окислительного взрыва нейтрофилов и макрофагов; 3) модуляция циклооксигеназной активности эндотелия и тромбоцитов; 4) участие в биосинтезе тиреоидных гормонов; 5) стимуляция выброса гистамина из тучных клеток; 6) обратимый сдвиг потенциал плазматической мембраны в сторону гипер- или деполяризации в зависимости от типа клеток; 7) создание определенного уровня редокс-потенциала в суставе; 8) является энергетически ценной молекулой: при распаде 1 М Н2О2 выделяется около 25 ккал энергии, что достаточно для синтеза 2 молекул АТФ; 9) вызывает SOS-ответ клетки на окислительный стресс; 10) участвует в редокс-сигнализации, вторичный посредник.

SOS-ответ клетки на окислительный стресс Показано, что обработка бактерий малыми дозами Н2О2 вызывает синтез более 30 белков с антиоксидантными свойствами, 9 из которых находятся под контролем гена oxyR. Этот ген интересен тем, что регулирует собственную транскрипцию. Ген oxyR связан с белком, имеющим активный сайт, который прямо «ловит» окислители (АКМ), вследствие чего меняется конформация белка. В результате этого комплекс белок-ген распадается и белок связывается с другими генами, находящимися под его контролем. Это показано и для фибробластов человека в культуре.

Н2О2-сенсоры регулируют поступление кислорода в организм и образование АФК Строение Н2О2-сенсора в плазматической мембране клеток Переход от отдыха к работе → потребление кислорода в тканях → [O2]  → [H2O2] → K+-канал →  на клеточной мембране → выделение серотонина → расширение дыхательных путей.

Жук-бомбардир и перекись водорода