Гендік инженерия презентация

Гендік инженерия 5В070100-Биотехнололгия мамандығы үшін.

№ 1 дәріс Гендік инженерияға кіріспе. Жоспары І. Гендік инженерия ғылымының даму тарихы ІІ. Гендік инженерия шешетін мәселелер ІІІ. Гендік инженерия пәнінің әдістері

Ген инженериясы молекулалық биологияның жаңа саласы. Ол лабораториялық әдіс арқылы генетикалық жүйелер мен тұқымы өзгерген организмдерді алу жолын қарастырады. Ген инженериясының пайда болуы генетиканың, биохимияның, микробиологияның және молекулалалық биологияның жетістіктерімен байланысты. Ген инженериясы молекулалық биологияның жаңа саласы. Ол лабораториялық әдіс арқылы генетикалық жүйелер мен тұқымы өзгерген организмдерді алу жолын қарастырады. Ген инженериясының пайда болуы генетиканың, биохимияның, микробиологияның және молекулалалық биологияның жетістіктерімен байланысты. Молекулалық биология ғылыми жетістіктерінің нәтижесінде пайда болған ген инженериясы организмнің бағалы қасиетін сақтап қана қоймай оған жаңа әрі саналы қасиет те бере алады. «Инженерия» деген атау құрастыру деген мағынаны білдіреді. Яғни ген инженериясы дегенді ген кұрастыру деп түсіну қажет. Ген инженериясының дәуірі басталмай тұрып 1969 жылы Г. Корана нуклеотидтерді белгілі бір жүйемен орналасқан ДНҚ синтезінің методологиясын жасап берген.

І. Гендік инженерия ғылымының даму тарихы Ген инженериясының дүниеге келген уақыты 1972 ж. деп есептеледі. Сол жылы Т. Берг алғаш рет пробиркада үш түрлі микроорганизмнің ДНҚ-ларының фрагменттерінен жаңа гибридтік ДНҚ құрастырды. Бірақ маймылдың рак вирусының, бактериофагтың және ішек бактериясының гендік ДНҚ-ларынан құрастырылған ол гибридтік ДНҚ-ның клетка ішінде ойдағыдай жұмыс істей алатындығы тексерілмеді, себебі құрамында рак вирусының нуклеин қышқылы болғандықтан ғалымдар тәуекелге бармады. Клеткада жұмыс істей алатын гибридтік ДНҚ-ны 1973-74 жылдары С. Коэн мен Г. Бойер құрастырды. Олар басқа организмнен бөліп алған ДНҚ фрагментін (генін) бактерия плазмидасының құрамына енгізді. Ол плазмидадағы бөтен гендердің алғаш рет жаңа организм ішінде жұмыс істей алатынын көрсетті. Соның артынша-ақ дүние жүзінің көптеген лабораторияларында жұмыс істей алатын әр түрлі плазмидалар алынды. Совет елінде ондай бөтен гені бар плазмида академик А.А. Баевтың басшылығымен жасалды.

І. Гендік инженерия ғылымының даму тарихы 1945-1950 ж.ж. Бірінші рет жануарлар жасушаларының культуралары өсірілді. XX ғ. 50 – ші жылдары адам жасушасының бірінші культуралары өсірілді. 1970 ж. Г. Смит және В. Арбер рестриктаза бөліп алды. 1972 ж. П. Берг С. Коэн, Х. Бойер рекомбинанты in vitro ДНК алды, ол SV-40 маймыл ДНК-ның бөліктерінен және E. coli мен λ фаг бактерияларының ДНК сынан құрастырылған еді. 1975. ж. Ф. Сэнгер ДНК анықтаудың тікелей әдісін үсынды. 1978 ж. Генді-инженериялық инсулин жасалды, ол кәдімгі ақуызға өте ұқсас болды. 1978 ж. Англияда бірінші пробиркадағы адам Луиза Браун дүниеге келді. 1985 ж. 4 қаңтарында Лондон қаласының бір клиникасында бірінші суррогатты ана атанған миссис Коттон қызды өмірге әкелді. 1986 ж. В гепатиты мен көптеген вирустық аруларға қарсы генді-инженериялық вакцина және генді-инженериялық интерферон жасалды.

І. Гендік инженерия ғылымының даму тарихы 1990 ж. Адамның генетикалық картасын құрастыру үшін халықаралық проект бастау алды. (Human Genome Project) 1993 ж. Генетикалық өзгертілген өнімдерді дүкен сөрелерінде сатуға рұқсат берілді. 1993 ж. К. Мюллис ПЦР әдісін ойлап тапқан үшін Нобел силығының лауреаты атанды. 1995 ж. Бактерия гені Haemophilus influenzae толық сиквенделді. 1996 ж. Ашытқы санырауқұлағы сиквенделді. (Saccharomyces cerevisiae) 1997 ж. Я. Уилмут және К. Кэмпбел Рослин Эдинбург институтында жануар эмбрионынан саулық Доллиды клондады. 2001 ж. Ауыл шаруашылық өсімдігінің (күріш) бірінші толық генетикалық картасы құралды. 2008 ж. 1000 адам геномын сиквендеу бойынша жоба басталды. (1 геномы сиквенделген адам Ф. Крик) 2010 ж. Крейг Вентр алғашқы “микоплазма микоидес” jcva sym 1.0 ағзасының геномын құрастырды.

ІІ. Ген инженериясы шешетін мәселелер: 1) генді химиялық немесе ферментті қолдану жолымен синтездеу; 2) әр түрлі организмнен алынған ДНҚ фрагменттерін бір-бірімен жалғастыру (ДНҚ рекомбинантгарын алу); 3) бөтен генді жаңа жасушаға векторлық ДНҚ аркылы жеткізу және олардың қызмет жасауын қамтамасыз ету; 4) жасушаларға гендерді немесе генетикалық жүйелерді енгізу және бөтен белокты синтездеу; 5) бөтен генге ие болған жасушаларды таңдап бөліп алу жолдарын ашу. 

ІІІ. Гендік инженерия пәнінің әдістері Ген инженериясында генді мынадай әдістермен алуға болады: клеткадағы ДНҚ-дан тікелей кесіп алу; химиялық жолмен синтездеу; аРНҚ-дан кері транскриптаза арқылы синтездеу. 1. Бірінші әдіс ген инженериясының дамуының алғашқы кезеңінде қолданыла бастады. Белгілі организмнің ДНҚ-сын түгелімен белгілі рестриктазалармен үзіп, қажетті фрагменттер алады. Содан кейін оны клетка ішіне арнайы плазмидалармен еңгізеді, Ол үшін плазмиданы да рестриктазалармен  үзеді, оған алынған ДНҚ фрагменттерін қосып жалғап, қайтадан бүтін плазмидалар алады. Бұл плазмидалардың әрқайсысының құрамында бір немесе бірнеше бөтен ДНҚ фрагменті (гені) болады, әрі қарай ол плазмидаларды қайтадан бактерияға еңгізеді. Осының нәтижесінде бактерия клеткасының әрқайсысында басқа организм генінің, бір түрі болады

ІІІ. Гендік инженерия пәнінің әдістері 2. Химиялық жолмен жасанды генді 1969 жылы Г. Корана синтездеген. Бірақ оған жалғасқан промотор тізбегі мен транскрипцияны аяқтайтын кодондар болмағандықтан, ол клетка ішінде ешбір қызмет көрсете алмады. Гендрді химиялық синтіздеуге нуклеин қышқылдарындағы нуклеотидтердің орналасу тәртібін анықтау әдісін тапқаннан кейін  ғана  мүмкіндік  туды. Бұл  әдістерді  тапқан  Д. Джильберт пен  Ф. Сэнгер. Ғалымдар  генді  белоктың құрамындағы амин қышқылдарына  қарап  отырып  синтездеуді де үйренді, (3 нуклеотид — 1 кодон — 1 амин қышқылы деген заңдылық бойынша). Соның ішінде қолдан синтезделген ең ұзын ген, адамның самототропин (өсу) гені, ол 584 нуклеотидтен тұрады. Оны бактериядағы басқа геннің промоторына жалғастырып, плазмида арқылы бактерия клеткасына еңгізді. Соның нәтижесінде бактерияның бір клеткасы 3 млн-ға дейін адам самототропин молекуласын жасай алатын болды. Адам инсулині де химиялық жолмен синтезделіп,  осы айтылған жолмен бактерияға еңгізілді.

ІІІ. Гендік инженерия пәнінің әдістері 3. Жасанды әдіспен генді ферменттік синтезге сүйене отырып, кері транскрипция механизмнің көмегімен алуға да болады. Бұл механизм РНҚ-ға тәуелді ДНҚ-полимеразаның немесе кері транскриптазаның (ревертазалар) белсенділігіне байланысты. Бұл фермент ең алғаш он-когендік (залалды ісік) вирустарды зерттегенде табылған. Фермент әртүрлі РНҚ-ларда, синтетикалық полинуклеотидтерді қоса, ДНҚ-ның көшірмесін құра алатын қабілеті бар. Ревертазаның көмегімен, сәйкес аРНҚ-ның қатысуымен, іс жүзінде кез келген бөліп алуы жақсы игерілген генді алуға болады. Бұл әдісті белгілі бір тіңдерде (тканьдарда) өте қарқынды транскрипцияланатын гендерге қолдану тиімді.

№ 2 дәріс Гендік инженерияда қолданылатын ферменттер. Жоспары І. Ферменттер класификациясы. ІІ. Рестриктазалар ІІІ. ДНК-лигаза ІV. ДНК-полимераза V. Кері транскриптаза

І. Ферменттер класификациясы. Гендік инженерия молекулалық генетикадан бастау алады, бірақ өзінің пайда болуымен генетикалық энзимология мен нуклейн қышқылдарының химиясының жетістіктеріне міндетті, себебі молекулалық манипуляциялардың негізгі құралы ол ферменттер. Гендік инженерияда келесі ферменттер қолданылады: Рестриктазалар ДНК-лигаза ДНК-полимераза Кері транскриптаза

ІІ. Рестриктазалар Рестрикция эндонулеазалары, рестриктазалар (лат. restrictio — шектеу) — Гидролаза классына жататы ферметтер тобы, нуклеин қышқылдарының гидролиз реакциясын катализдейді. Экзонуклеазалардан айырмашылығы, нуклейин қышқылын сонынан емес ортасынан ыдыратады. 1953 ж бірнеше зертханада белгілі бір E. Coli штамының ДНҚ-сын басқа штманың жасушасына енгізгенде ол ешқандай генетикалық белсенділік білдірмеді, себебі тез арада кішкентай бөлшектерге ыдыратылып отырған. Ең бірінші 1968 ж рестриктаза ферменттерін тапқан Мезельсон мен Юань, олар оны ішек таяқшасының EcoK-12 штамынан бөліп алды. Дәл сондай ферменттерді Е. Сoli-дің EcoВ штамдарынан табылды. Кейінірек 1970 ж Смит және Вилькос Haemophilus influenzae-дан ДНҚ-ның қатал белгілі бір тізбектегі ретін кесетің бірінші рестриктаза ферментін алды.

ІІ. Рестриктазалар Рестрикция – белгілі бір тізбекте нуклеотиддтер қатарын танып 2 тізбекті ДНҚ-ны бөлшектерге кесу. Осы рестрикцияға қарама қарсы процесс ол модификация. Осы модификация кезінде метилтрансфераза ферменті ДНҚ-ның аденин мен цитозин қалдықтарына метильді топтар қосады дәл рестриктаза ферменті бекейтін жерге. Нәтижесінде метилденген тізбек рестриктаза ферментіне тұрақты болады.

ІІ. Рестриктазалар 1973 ж Смит және Натанс рестриктазалардын номенглатурасын ұсынды, ол келесі тармақтардан тұрды : Әр ферменттін атауын құру үшін сол микроорганизім атауының бірінші әріпі қай туысқа жататының ал қалған екі әріпі қай түрге жататының көрсетеді. Streptomyces albus - Sal, Escherichia coli - Eco Қажет болған жағдайда серотиптін немесе штамын көрсетіледі, мысалы Есо B. Бір бактериямен кодталатын әртүрлі рестрикция-модификация жүйелері римдік әріпен белігленеді: Hind II, Hind I, Hind III (Haemophilus influenzae). Рестриктазалар - R (R Hind III) әріпімен белгіленеді, метилазалар - М (М Hind III) әрпімен белгіленеді.

ІІ. Рестриктазалар Жаңа рестриктазалардың ашылуына байланысты, 1978 ж Робертс номенглатураға өзгерістер енгізді: егер қысқартулар бірнеше фермент атауымен сәйкес келсе, онда бірінші 2 әрпі өзгеріссіз қалып, ал үшінші әрпі түрлік атаудын келесі әріптерінен алынады: Haemophilus parainfluenzae - Hpі I Haemophilus parahaemolyticus  - Hph I.

ІІ. Рестриктазалар Рестриктазалар ДНҚ әртүрлі ыдыратады (1 сурет). Біреулері симетрия осі бойынша тура үзілістер жасаса (Hpa I, Ssp I), басқалары жылжытып саты тәрізді кеседі (Pst I). Бірінші жағдайда жабысқақ емес ("тупые") ұштар қалыптастырса екінші жағдайда жабысқақ ("липкие") ұштар қалыптастырады және олар бір-біріне комплементарлы үзындығы 4 нуклеотид аймақтарынан тұрады. Осындай бөлшектер рекомбинанты ДНҚ құрастыру үшін қолайлы.

ІІ. Рестриктазалар Рестриктазаларды 3 негізгі классқа бөледі. 1 –ші класс рестриктазалары ерікті жерлерде үзінділер жасайды. Мысалы осы класқа жататын  ЕсоК (Escherichia coli К12) рестриктазасы арнайы тізбекті танып 400-700 арақашықтықта кеседі. 2 –ші класс рестриктазалары (мысалы EcoRI) үзындығы 4-8 нуклеотидтер жұбынан тұратын полиндромды тізбекті таниды және сол жерде кеседі. (шалаш типті) EcoRI гексо (6) нулеотитті тізбекті танып жабысқақ түптерді қалыптастырып кеседі, ол А мен G арасын кеседі. 3 – ші класс рестриктазалары ұзындығы 5-6 нуклеотидтер жұптарын танып ДНҚ-ны тану сайтына 24-27 арақашықтығында кеседі.

ІІ. Рестриктазалар 1 және 3 класс ферменттері күрделі суббірлікті құрылымға ие, олар екі белсенділікке ие: модификациялық және АТФ-тәуелді эндонуклеазалық. 2 –ші класс рестриктазалары екі бөлек ақуыздан тұрады: рестрикциялаушы эндонуклеазалар және модиффкациялаушы метилаза, сол себепті осы класс ферменттерін гендік инженерияда кен қолданады. Олар Мg иондарын қажет етеді кофактор ретінде. 2- ші класс рестриктазалары мелко және крупно шипящие деп бөлінеді. Мелко шипящи – тетронуклеотид таниды (Hpa II, Alu) Крупно шипящи гексо нуклеотит таниды (Eco RI, Hind III)

ІІ. Рестриктазалар Әртүрлі микроорганизімдерден бөлінген ферменттер арасынан ДНҚ-да бірдей (одни и те же последовательности) тізебктерді танып кесетін түрлері де кездеседі, олар Изошизомерлер деп аталады. Изошизомерияның шынайы және жалған түрлерін ажыратады. Шынайы түрінде фермент бірдей тізбектерді танып дәл сол жерден кеседі, жалған түрінде бірдей тізбектерді танып сол тізбектін басқа жерінде үзіліс жасайды.

ІІ. Рестриктазалар Рестриктазаның әсер ету механизімі және ДНҚ-ны метилдеу системасы. Рестрикцианың нысана ретінде көбіне 4-6 полиндромды жұп негіздер қолданады (типа шалаш). Рестрикция реакциясы екі сатыда жүреді. Бірінші ДНҚ-ны бір тізбегі кесіледі, кейін екінші тізбегі кесіледі. Кесілген жерлерде экзонуклиазалық дегродация жүруі мүмкін, сол жерлерде АТФ-тың күшті гидролизі жүреді. Толық метилденген сайт рестрикцияға да модификацияға да тәуелді емес. Жартылай метилденген сайт рестрикция ферменттерімен танылмайды, бірақ метилаза көмегімен толық метилденуі мүмкін. Метилденбеген сайт рестриктаза ферментінің немесе метилаза ферментінің субстраты болады.

ІІІ. ДНК-лигаза Лигаза (лат. ligāre — тігу, біріктіру) әртүрлі молекулалардың (белоктардың, нуклеин қышқылының, пептидтердің т. б.) бір-бірімен қосылуына катынасатын ферменттер тобы. Табиғатта кең тараған, ақуыздарды, липидтерді, көмірсуларды түзуде үлкен роль аткарады. 100-ден астам лигазалар белгілі. Кейінгі кезде олар нуклеин қышқылдарын «тігу» үшін биотехнология саласында айрықша қолданылып жүр. Олар өзгеше биологиялық қасиетке ие жаңа ген жасауда да өз орнын алады. ДНҚ-лигаза — қос тізбекті ДНҚ-ның біреуі үзіліп қалғанда фосфодиэфир байланысты 5’- фосфорилді және 3’- гидроксиліді топтар арасында қалыптастырып, үзілген жерді "тігеді. Осы байланысты қалыптастыру үшін лигазалар АТФ-тің пирофосфарилді байланысының гидролиз энергиясын қолданады. Ең кен тараған қол жетімді комерциялық фермент ол Т4 бактериофагінің ДНҚ-лигазасы.

ІІІ. ДНК-лигаза Гендік инженерияда ДНҚ-лигазаның екі түрін қолданады. Олар бір-бірінен әсер етуі және кофакторды қажет етуі жағынан ерекшеленеді. E. Coli-дің ДНҚ-лигазалары кофактор ретінде дифосфопиридинуклеотидті қажет етсе, ал Т4-фагтың лигазасы Мg2+ иондарын қажет етеді. Т4-фагтың лигазасы универсалды, себебі ол жабысқақ түптерді байланыстырып қана қоймай, жабысқақ емес екі тізбекті ДНҚ бөлшетерінің бірігуін де катализдейді, сол себебпті ол жиірек қолданады.

ІV. ДНК-полимераза Бірінші рет ДНҚ-полимераза 1958 ж E. Coli-дан Коренберг және қызметкерлермен бірге бөлініп алынды. ДНК-полимераза — ДНҚ репликациясына қатысатын фермент. Бұл класс ферменті ДНҚ-ның нуклеотидетр тізбегінің бойында дезоксирибонуклеоитидтердің полимеризациясын катализдейді, оны фермент оқып шаблон ретінде қолданады. Бұл фермент молекулалық салмағы 103 кДа болатын мономерлі полипептидті тізбектен тұрады және 3 доменді құрылымнан тұрады, әр домен өзіне тән ферментативті белсенділіктен тұрады.

ІV. ДНК-полимераза 1. 5’-3’ полемиразалық белсенділікке ие. Реакция үшін бір тізбекті ДНК-матрица және осы бөлікке көмплементарлы 3’-ОН сонымең праймер фрагменті қажет. 2. 3’-5’ экзонуклеазалық белсенділікке ие. 3’-ОН сонынаң біртізбекті, екітізбекті ДНҚ-ны гидролиздейді. 3’-5’ экзонуклеаза ДНҚ-синтізі кезіндегі қателіктерді жояды. 3’-5’ экзонуклеаза ДНҚ-ның тек қана бірікпеген бөліктерінде диэфирлі байланыстарды ыдыратады. 3. 5’-3’ экзонуклеазалық белсенділікке ие. Бос 5’-сонынан бастап екі тізбекті ДНҚ-ның бір тізбегін (цепь) деградациялайды. 5’-3’ экзонуклеазаның 3’-5’ экзонуклеазадан айырмашылығы 5’-3’ экзонуклеаза ДНҚ-ның тек қана бірікен бөліктерінде диэфирлі байланыстарды ыдыратады, оған қоса 3’-5’ экзонуклеаза бір мезетте бір нуклеотидті кессе (расщеплять), 5’-3’ экзонуклеаза 5’-сонына ұзындығы 10-қалдықтан тұратын олигонуклеолитдерті кесе алады.

V. Кері транскриптаза Ревертаза — кері транскриптаза. Кері транскрипция (яғни РНҚ негізінде ДНҚ түзу) жүргізетін фермент. Өте сирек фермент, ол тек ретровирустардың құрамында табылған. Трансферазалар тобына жатады. Оның әсерінен ең алдымен РНҚ —ДНҚ буданы пайда болады, одан соң ДНҚ-полимеразасының катынасуымен ДНҚ түзіледі, ол тізбек екі есе көбейеді. 1964 ж Темин РНК-матрицасында комплементарлы ДНК синтездейтін вирусспецификалық фермент бар екендігі жәйлі гипотиза ұсынды. Көптеген таппыныстардың нәтижесінде 1970 ж Темин мен Мизутани және олардан тәуелсіз Балтимор іздеген ферментті “Раус саркома” вирусының клеткадан тыс виринондарының припаратынан табады.

V. Кері транскриптаза Кері транскриптаза үш ферментативті белсенділікке ие. 1. ДНК-полимеразалық, ол матрица ретінде ДНҚ-ны да РНҚ-ны да қолданады. 2. РНҚаза Н белсенділігі, РНҚ-ДНҚ гибрид құрамында РНҚ-ны гидролиздейді, бірақ бір немесе екітізбекті РНҚ-ны емес. 3. ДНҚ-эндонуклеазалық белсенділік. Бірінші екі белсенділік вирустық ДНҚ-ны синтездеу үшін қажет, ал эндонуклеаза вирустық ДНҚ-ны қожайын жасушасына енгізіп синтезді бастау үшін қажет деп есептеледі, себебі ревертазаға басқа ферментер секілді қысқа екі тізбекті аймақ қажет. (Праймер ретінде)

V. Кері транскриптаза Кері транскрипция реакцияларын арнайы тандалған жағдайларда және РНҚазалық белсенділікке ие күшті ингбиторларды қолдану арқылы іске асырады. Матрица ретінде кДНҚ-ның бірінші тізбегі (цепь) қолданылады. Бұл реакция ревертазамен немесе E. Coli-дің ДНҚ-полимераза І көмегімен де катализдеуге болады. Синтез аяқталғанан кейін пайда болған екітізбекті кДНҚ-ны клондалған векторға тасымалдауға болады.

№ 3 дәріс Векторлар Жоспары І. Векторлар және оларға қойылатын талаптар ІІ. Вектор түрлері

І. Векторлар және оларға қойылатын талаптар Вектор деп бөтен генетикалық материалды (ДНҚ фрагментін) клеткаға (реципиенттің) тасымалдауға қабілетті ДНҚ молекуласын айтады. Векторлар — ген тасығыштар, ал вектор деген сөздің өзі бағыттағыш деген мағынаны білдіреді. ДНҚ молекуласын векторсыз, мысалы, бактериялық клеткаға енгізсе, онда оларды бактериялық ферменттер ыдыратып жібереді. Кейбір жағдайда ДНҚ сақталуы мүмкін, бірақ клетканың бөлінуінде олар тұқым қуаламайды. Осындай жағдай болмас үшін векторлық молекулалар қолданылады. 

І. Векторлар және оларға қойылатын талаптар Векторларды эксперименттік жолмен құрастырады және оларға келесі талаптар қойылады: 1) Репликация сайты (Ori); 2) құрамында рестриктазалар танып, үзе алатын нуклеотидтер тізбегі болуы керек, әйтпесе векторға ДНҚ фрагментін енгізу мүмкін емес;   3) оның, бір немесе бірнеше таңбаланған гендері (маркерлері) болуы керек, сол таңбалар бойынша қажет геннің клетканың (реципиенттік) ішіне енгенін анықтайды; 4) вектордың, клетка ішіндегі көшірмелері жеткілікті мөлшерде болуы керек. 5) Мөлшері үлкен болмауы тиісті. 6) Вектордың көбиюіне жасуша ішінде ештене бөгет жасамауы тиісті.

І. Векторлар және оларға қойылатын талаптар Векторлық молекуланың шығу козі болып   бактериялық плазмидалар мен вирустар (әсіресе фагтар) саналады. Векторлардың негізгі 6 түрі бар. 1. Плазмида 2. Космида 3. Фазмида 4. Шаттл вектор 5. Жасанды бактериалды хромосомалар 6. Жасанды ашытқы хромосомалар

1. Плазмида Плазмидалар — хромосомадан тыс реплекацияланатын ДНҚ молеукуласы. Плазмидалар көбінесе бактерияларда кездеседі, ол екі тізбекті сақина молекулалары. Вектор ретінде мөлшері 15— 20 мың н. ж. дейінгі, көбінесе 2-ден 10 мың н. ж. құралған кішігірім плазмидалар қолданылады. Плазмидалық векторлар генді бактерияларға тасымалдап, оның тиімді жұмысын қамтамасыз ете алады. Плазмида терминің ең бірінші рет америкалық молекулалық биолог Джошуа Ледербергпен 1952 ж. ұсынылды.

1. Плазмида Мөлшері және саны Кейбір плазмидалардың жасушадағы саны 10-100 көшірме (copies) оларды көп көшірмелі плазмидалар д.а. Егер жасушада көшірме саны 1-4 аралығында болса оны аз көшірмелі плазмида д.а. Геометриясы Плазмидалардың көбісі сақиналы (кольцевые) болсада тізбекті (линейные) плазмидасы бар бактерияларда кездесіді.

1. Плазмида Плазмиданы жасушаға тасмалдау жолдары. Конъюгация Трансдукция трансформация

1. Плазмида Плазмидалар қызметі Плазмидалардың көбісі иесінің фенотипінде айтарлықтай өзгерістер әкелмейді. Басқалары керсінше жасуша иесіне белгілі бір қоршаған ортада тірі қалуға көмек беретін қасиетер болуына жауапты.

1. Плазмида Плазмидалардың жасушадағы қызметі әралуан түрлі, оларға келесілер жатады: Гемолизин синтезі - Hly-плазмида; Ауыр металдарға төзімділік; Энтеротоксиндердің синтезі - Ent-плазмида; УФ – төзімділік; Антиген синтезі – антиген колонизациялаушы плазмидаоар; рестрикция-модификация жүиелері; Камфораны ыдарату (САМ п.), ксилолды (XYL п.), салицилатты (SAL п.) (Pseudomonas кейбір штамдарынан табылған).

1. Плазмида F-плазмида - Escherichia coli K-12 жасушасының конъюгативті эписомасы, бактериялялардың жыныстық көбиюінің бірт түрі – конъюгацияға қатысатын жасушалық элимент. Сақиналық ДНҚ-ның мөлшері 94,5 мың н.ж. Ода өзінің репликация бастайтың сайты - oriV және үзу нүктесі бар – oriT. R-плазмида- сақиналы екі тізбекті ДНҚ молекуласы, бұл плазмидада репликация механизімі және жасуша реципиентке резистентілік қаситетін беруге жауапты гендері бар, бұдан басқа белгілі бір антибиотикке тұрақтылық көрсететін гендері бар. Col-плазмида – колицин деген ерекше ақуыздарды синтездейді, басқа бактериялардың өсуі мен көбиюін тежейді бірақ оны өндіруші бактерияға зиянсыз. Бұл феномен 1925 ж.  A. Gratia E. coli. Штамынан табады.

1. Плазмида

1. Плазмида Плазмидаларды классификациялайтын бірнеше системалар бар, олар келесі ерекшеліктерге негізделген: топология (тізбекті немес сақиналы), Репликация механизмі бойынша, Плазмидадағы маркерлік гендерге байланысты, Көшірмелерге байланысты, конъюгативті / конюгативті емес.

2. Космида Космида (Cosmides) — құрамында лябда фагтың ДНҚ сының фрагменті және соs-телімі (участок) бар плазмида. Гендік кітапханалар құру үшін қолданылады. Космидаларды бірінші рет 1978 ж. Коллинс және Брюнинг құрастырады. Космида көмегімен 32-47 мың н.ж болатын мөлшердегі ДНҚ-ны тасмалдауға болады, салыстырмалы түрде плазмида көмегімен тек 4-5 мың н.ж мөлшерде ДНҚ-ны ғана тасмалдауға болады. Оған қоса космидалар фагты бөлшектерге оралады, бұл оларды трансдукция көмегімен бактерияға енгізуге мүмкіндік береді, және космида жасанды түрде құрастырылады.

3. Фазмида Фазмида (phasmid) [грек. pha(gos) — жеуші және plasma — құрастырылған] — гибридті вектор, фаг және плазмида геномының бөліктерінен құралған. Фазмидаға бөтен ДНҚ-ны еңгізгенен кейін бір жағдайларда фаг ретінде, басқа жағдайларда плазмида ретінде дамиды.

4. Шаттл вектор Рекомбинанты вектор, прокариот және эукариот жасушаларында репликациаланатын аймақтары бар. Мысалы pFH7 плазмидасы екі репликон біріктіруінен пайда болған, біреуі B. Subtilis –тің pC194 плазмидасынан бастау алса, екіншісі E. Coli - pBR322 плазмидасы, бұл қасиет векторға E. Coli-де және B. Subtilis-де репликациялануға мүмкіндік береді.

5. Жасанды бактериалды хромосомалар ВАС F-фактордың репликация инициация нүктесі мен екі жас жасушаға плазмидтердің ажыратылуын қамтамасыз ететін плазмидтік векторлар. ВАС плазмидтерді бактериялық хромосомадан бөліп алу оңай. ВАС-тар ұзындығы 100-3000 кб болатын рекомбинатты ДНҚ-ны қабылдай алады. ВАС адам геномы жобасында хромосомалардың үлкен бөліктерін клондау мен секвенирлеу кезінде қолоданды.

6. Жасанды ашытқы хромосомалар S. Cerevisiae үшін экспресияланатын 3 вектор түрі бар: 1. Эписомалық, немесе плазмидалық векторлар (YEps) 2. Интеграциялық векторлар (Yips) 3. Жасанды ашытқы хромосмалары (YAC)

6. Жасанды ашытқы хромосомалар 1. Плазмидалық векторлар секреттелетін және секреттелмейтін гетерологиялық ақуыздарды алу үшін кен қолданылады. Бірақ плазмида негізіндегі экспрессия системалары жасушаны үлкен көлемде (>10 л) өсірген кезде тұрақты болмайды. 2. Экспрессиялаушы вектордын хромосомалық ДНҚ-ға интеграциясы кезінде стабилді рекомбинатты ағза пайда болатына қарамастан екінші типті вектор кен қолданыс таппады, себебі клондалған геннің көшірмелер саны хромосомаға бір генмен шектеледі, басқа сөзбен айтқанда ақуыздың шығымы төмен болады. 3. E. coli жасушаларында өсірілген және ашытқы (S. Cerevisiae) жасушаларына енгізілген кіші плазмидалар. YAC экариотты хромосоманың кішкентай моделі. YAC-тар құрамына репликация ориджині, селективті маркерлер мен клетка бөліну процесінде YAC-тың жаңадан пайда болған клеткаларына сегрегациясын қамтамасыз ететін 2 теломера мен 1 центромера кіреді. Бөтен ДНҚ фрагменттері YAC-тың ортасында орналасқан рестрикция сайттарына енгізіледі. YAC-тар ұзындығы 200 кб-дан (1 кб = 1000 н.ж) 2 мегабазға (1 мб = 1 миллион н.ж) дейін үлкен ДНҚ фрагменттерін енгізуге мүмкіншілік береді. YAC-тар ВАС-тар секілді адм геномы жобасында маңызды рөл атқарды.

№ 4 дәріс Геннің химиялық синтезі. 1. Ашылу тарихы. 2. ДНҚ Синтезатор 2. Химиялық синтездің фосфорамидиті әдіс

1. Ашылу тарихы. Берілген нуклеотидтер тізбегі бойынша ДНҚ - синтездеу әдісін 1969 жылы Г. Корана ұсынған болатын. Ашытқы  тРНҚ-ның гені осылай синтезделді. Бұл ген 77 н. ж. құралған. Алдымен, ұзындығы 5—12 нуклеотидтерден тұратын ДНҚ-ның қысқа фрагменттері синтезделді, сдан соң олар арнайы ферменттің (лигаза) әсерімен бір-бірімен қосылды. Алайда, алғаш синтезделген бұл генді ішек таяқшасының клеткасына енгізген кезде жұмыс істей алмады, өйткені онда реттеуші элементтер — промотор және терминация бөліктері жоқ болатын. Кейін, 1976 ж. Г. Корана қызметкерлерімен тирозиннің тРНҚ-ының генін синтездей алды. Геннің ұзындығы 126 н. ж. тең болды, оған 52 н. ж. құралған промотор, 21 н. ж.— терминатор және ұштарына тетрануклеотидтер (ААТТ және ТТАА) жалғанды. Нәтижесінде, осы генді бактериофаг арқылы Е. Со1і клеткасына енгізгенде олар өз функциясын көрсете алды.

2. ДНҚ Синтезатор Қазіргі кезде гендерді автоматты синтездейтін құралдар бар. 1980 ж. Итакура алғаш өзі алдын ала берілген тізбек бойынша 6 сағ. ішінде 12-н.ж. тұратын олигонуклеотидті синтездеуге қабілетті автоматты жұмыс істеуші компьютерді қолданды. Мұндай жабдықтардың 1982 жылғы бағасы 36000—39500 долларға тең болатын. Егер 1979 жылы 120 н. ж. генді синтездеу үшін екі жыл керек болса, ал 1981 ж. бұл мақсатқа үш күнде жетуге болды.

ДНҚ синтезатор. (Biosset)

2. Химиялық синтездің фосфорамидиті әдіс Кәзіргі уақытта химиялық синтездің ен кен атарлған әдісі. Бастапқы құрушы блоктар ретінде модификацияланған дезоксирибонуклиозидтер болып табылады. Синтез 8 сатыдан тұрады.

2. Химиялық синтездің фосфорамидиті әдіс

2. Химиялық синтездің фосфорамидиті әдіс 1. Синтездің бірінші сатысында өсіп келе жатқан ДНҚ тізбегі қатқыл инерты тасымалдаушыда бекітіледі, көбінесе санылаулы шыны шариктер қолданылады. Осының арқасында барлық реакцияларды бір ыдыста іске асыруға мүмкіндік береді, яғни әр этаптан кейін қажет емес реагентерді шайіп жаңа реагенттерді қосу секілді процестерді іске асыруға мүмкіндік береді. Спецификалық емес байланыстарды болдырмас үшін екінші нуклеотидті реакциялық қоспаға қоспай тұрып бірінші нуклеотидтің 5’-гидроксильді тобына (ДМТ) диметокситритильді топен қорғайды. Бұл топт әр келесі қосылған нуклеотидте болады, ал 3’-гидроксильді топқа спейсерді молекула бекейді, ал оған өз кезегінде шыны шарик бекиді.

2. Химиялық синтездің фосфорамидиті әдіс 2. Сатыда колонкадан су мен басқада нуклеофилді заттарды жою үшін сусыздандырығлан реагент көмегімен (ацетонитрил) шайып, кейінен ацетонитрилді шығару үшін аргонмен үреді. 3. Сатыда трихлоруксус қышқылымен (ТХУ) нуклеотидты шайады. Бұл 5’ ДМТ-ді (диметокситритиль) бекітілген нуклеотидтен ыдыратып, реакционды қасиетін сол топқа қайтару үшін іске асырады.

2. Химиялық синтездің фосфорамидиті әдіс 4. ТХУ-нан құтылу үшін ацетонитрилмен шаяды, кейінен аргонмен үріледі ацетонитрилден құтылу үшін. 5. Сатыда Тетразол фосфорамидитті активтендіреді сонын нәтижесінден 3’ - фосфитті топ 5’ – гидроксилді топпен коваленті байланыс арқылы байланысады. ДМТ- диметокситритильді топ. МЕ- метильді топ.

2. Химиялық синтездің фосфорамидиті әдіс 6. Сатыда қосылмаған фосфорамидит және теразол аргонмен үрлеп шығарады. 7. Сатыда жауап қатпаған 5’ – гидроксилді топты уксусты ангидрид және диметиламинопиридин көмегімен ацетилидейді. Себебі тасымалдаушыдағы барлық нуклеозидтер фосфорамидитпен байланыспауы мүмкін. Егер осы кезенді іске асырмаса бірнеше кезеннен кейін синтезделіп жатқан олигонуклеотидтер үзындығы және нуклеотидтер тізбегі жағынан айырмашылықтары болуы мүмкін.

2. Химиялық синтездің фосфорамидиті әдіс

2. Химиялық синтездің фосфорамидиті әдіс 8. Сатыда нуклеотидер арасында қалыптасқан фосфиттриэфирлі байланыс қалыпты болмауы мүмкін, осы байланыс қышқылдар әсерінен үзілуі мүмкін. Сол себепті фосфиттриэфирлі байланысты иод ерітіндісі арқылы стабильді 5 валентті фосфаттриэфриға дейін тотықтырады. Содан кейін калонканы жуып барлық цикілді қайталайды.

2. Химиялық синтездің фосфорамидиті әдіс

2. Химиялық синтездің фосфорамидиті әдіс Жоғарыдағы цикл бағдарламаға сәйкес өсіп келе жатқан тізбекке сонғы нуклеозид жалғанып бітпегенше қайталана береді. Сонғы шықан өнім таза болу үшін әрбір кезендегі нуклеотидтердің бірігу эффективтілігі 98% төмен бомауы керек. ДНҚ синтезаторды Өндіруші фирмалар бекіну эффективтілігі 98% төмен болмайтының кебілдейді. Бірақ ол көрсеткішке жету үшін өте таза химикаттар мен реагенттер қолданылуы тиісті. Көбіне жоғары тазалыққа жету үшін ВЖХ немесе электрофорез көмегімен қосымша тазартылады.

2. Химиялық синтездің фосфорамидиті әдіс

№ 5 дәріс Генді инженериялық манипуляциялар. Генді инженериялық манипуляция кезендері: 1. Қажетті ДНҚ-ны бөліп алу. 2. Вектор. 3. Трасфорамция және селекция.

Генді инженериялық манипуляция кезендері: Биологиялық зерттеулердің көбісі бір қарапайым процестен басталады яғни – жасушаға бөгде генетикалық материял енгізіледі. Бұл процесс молекулалық клондау деп аталады. Осы процесс көмегімен гендік модификацияланған ағзалар алуға және бөлек генддерді қыстырып сөндіруге және т.б процестерді іске асыруға болады. Бірақ жасушаға бөгде генді енгізу қарапайым естілгенімен, бұл ұзың, қиын және көп этапты процесс.

1. Қажетті ДНҚ-ны бөліп алу. Біздің мақсатымыз жасушаға белгілі бір генді енгізу болғандықтан, ең бірінші бізге жасауға қажетті зат ол – қажетті генді белгілі бір жолмен алу және оған қоса ол генді көп мөлшерде алу. Жасушаға енетің бөгде ген – енуші ген (insert) д.а. Оны бірнеше әдіспен алуға болады: Біріншіден, біз қажетті генді тиесілі ағзадан бөліп ала аламыз. Қарапайым мысал ретінде біздің енуші ген бұл пілдің белгілі бір гені. Олай болса бізге келесі әрекеттерді іске асыру керек: Пілдің тініңін (такн) үлгісін алу. Сол үлгіден ДНҚ-ны бөліп алу. Сол ДНҚ дан бізге қажетті генді көп мөлшерде оқшаулап алу. (Ол үшін ПЦР қолданылады. Бірақ ПЦР көмегімен генді алу үшін, біз сол геннін нуклеотидтік тізбегін білуіміз қажт.) Екіншіден, егер бізге қажетті пілдің гені гендер кітапханасында болса, онда біз сол кітапханадан ала саламыз. Үшіншіден, енуші ген міндетті түрде бізге белгілі ағза болмауы мүмкін, зерттеуші ол генді өзі ойлап табуы мүмкін, және ол генді жасанды түрде синтездеп алуға болады.

2. Вектор. Жасушаға жалғыз енуші генді (insert) ешқандай қолдаусыз енгізу мәнсіз зат. Себебі жасушада көптеген қорғаушы ДНҚ ферменттер бар. (нуклеазалар класы) Сол себпті енуші генге (insert) арнайы «тасмалдаушы жүйе» қажет яғни вектор. Векторлардың бірнеше түрлері бар, бірақ ішінде ең кен қолданылатыны ол – плазмидалар.

2. Вектор. 80-ніңші жылдары pBR322 плазмидалық векторры ең әйгілі және уневирсалды веторлардың бірі болған. Плазмида ұзындығы 4361 н. ж. Ампицилин және тетрациклин антибиотиктеріне тұрақты екі гені бар. Tet генінде уникалді сайтар BaмHI, HindII, SalI үшін, және PstI сайты Amp генінде орналасқан (негізі осындай сайттар саны 40-қа жуық), ал EcoRI кодталмайтын тізбектере орналасқан, және E. coli жасушасында репликацияланатын басталу сайты бар. Бөгде ДНҚ BaмHI сайтына орнығады.

2. Вектор. Промоторлар, Энхансерлер, сайленсерлер. Әрбір жұмыстеуші геннің алдында қысқа ДНҚ аймағы Промотор бар. Дәл сол жерге РНК полимераза бекиді. Промоторлар әр түрлі болады: Біріншіден олар күші жағынан әртүрлі болады. Екіншіден прокариот және эукариот промоторлары әртүрлі. Үшіншіден эукариоттарда РНК полимеразаның бірнеше типі бар. Әр РНК полимеразаны өзінің танитың промоторлары болады. Төртіншіден әртүрлі промоторлар әртүрлі қосылады. Біреулер әрдайым жұмыс істеп тұрса, екіншілері керсінше белгілі бір жағдайларда ғана жұмыс істейті. (тем. Белгілі бір зат.) Эукариоттарда промоторлардаң басқа ген экспрессияны регуляциялайтын ДНҚ аймақтары бар, энхансерлер (транскрипцияны күшейткіштер), сайленсерлер (транскрипцияны бәсендетушілер).

3. Трасфорамция және селекция. Бактерия плазмиданы жұту процесі трансформация д.а. Трансформация іске асу үшін келесі жағдайлар қажет: Антибиотикке тұрақты екі геннің біреуін рестриктаза көмегімен кеседі нәтижесінде жабысқақ үштары бар түзу тізбек пайда болады. Осы пайда болған тізбекті донорлы тізбекпен араластырады, ары қарай бұл қоспаны Т4 бактериофагтың ДНҚ-лигазасынмен араластырады. Нәтижесінде рекомбинантты ДНҚ молекуласы пайда болады, оларда екі бір тізбекті үзілістері болсада онын бөліктері екі фосфодиэфирлі байланыстармен үсталып тұрады. Трансформацияланған келтакада репликациядан кейін біртізбекті үзілістер жасуша иесінің лигазаларының көмегімен біріктіріледі.

3. Трасфорамция және селекция. Трансформация қасиет барлық бактерияларға тән емес, яғни тек компетентті жасушаларға ғана тән. Сол себепті палазмиданы бактерияға енгізген кезде біз алдынала білеміз, бактериялардың көбісіне плазмида енбейтіндігін, яғни трансформацияланған бактериялар саны аз болатындығын. Сол себепті бізге тек трансформацияланған жасушаларды ғана бөліп алу керек. Ол үшін қарапайым бірақ өте тапқыр әдіс қолданылады.

3. Трасфорамция және селекция. Ол әдістің мәні келесі: Біз pBR322 плазмидасында Аmp және Tet антибиотикке төзімді гендері бар екенін білеміз (Selectable marker). Сол себепті осы плазмида енген жасуша сол антибиотикке төзімді болады және сол антибиотик бар ортада өмір сүре алады. Бірінші кезенде жасушаны трансформациядан кейін ампицилин бар ортада өсіреді. Трансформацияланған жасуша тірі қалады. Бірақ егер жасуша ампицилин бар ортада өсе оның ішінде бізге қажетті ген бар деген сөз емес, сол себепті келесі кезекте Tet ортада жасушаларды қайта өсіреді. BaмHI сайты Tet генінде ораналасқандықтан BaмHI сайтына енген ДНҚ фрагменті ол сайтты бұзады және жасуша Tet бар ортада өсе алмайды, бір сөзбен айтқанда бізге қажетті ген BaмHI сайтына енгенің білдіреді. Екінші кезенде осы екі нұсқаны бөледі. Көшіру әдісі арқылы ампицелин ортасында өскен жасушаларды тетрацеклин бар Қ.О көшіреді. Тетрацеклин бар Қ.О өспеген жасушалар болса оларда гибридті плазмида бар деген сөз. Ампицелин бар Қ.О өскен бірақ тетрацеклинді Қ.О өспеген жасушаларды тандап аладыда жаңа Қ.О өсіреді.

№ 6 дәріс ДНҚ-ны секвенирлеу 1. Секвенирлеу тарихы 2. Сэнгер әдісі

1. Секвенирлеу тарихы Секвенирлеу бұл – нуклеин қышқылдарынының нклеотидтік ретін анықтау әдісі. Жоғары эфиктивті секвенирлеу әдісінің пайда болуына көптеген әдістердің бірігуі әкеп соқты, солардың ішіне келесі әдістер жатады: Елеулі орын алатын әдістің бірі бұл электрофорез әдісі, бұл әдістің дамуы не бәрі 1 нуклеотид ұзындығы болатын олигомерлерді бөлуге мүмкіндік берді. Азотты негіздердің спецификалық химиялық модификация әдісі. P 32 изотопы арқылы ДНҚ тізбегіндегі ақырғы (концевых) нуклеотидтердің радиоктивті таңбалау әдісі. ДНҚ тізбектерін ДНҚ полимеразамен көшіру әдісі.

1. Секвенирлеу тарихы ДНК-ның құрылымын анықтаудың көптеген әдістері белгілі, солардың ішінде Максам және Гильберт ұсынған химиялық әдіс немесе 1977 ж. Ф. Сэнгер ұсынған дидеокси әдісі. Кәзіргі уақыта басқа да жаңа әдістер ашылуда мысалға Шотган (Shotgun) секвенирлеу әдісі, бірақ Сэнгер ұсынған әдісі кен ауқымда қолданылады.

2. Сэнгер әдісі Сэнгер ұсынған әдісте ерекше дидезоксирибонуклеотидтер (ddNTP) деп аталатын модификацияланған нуклеотидтер қолданылады. ddNTP-тердің кәдімгі dNTP-терден кішкентай айырмашылығы бар. Олардың қантының 3-ші көміртегісінде гидроксилді-ОН тобының орнына сутегі тобы болады. ddNTP ДНҚ тізбегіне енген кезде, фосфодиэфирлік байланысқа қажетті ОН тобы болмағандықтан, тізбек ұзара алмайды; нәтижесінде тізбек терминацияланады.

2. Сэнгер әдісі

2. Сэнгер әдісі Сэнгердің дәстүрлі тәсілінде 4 бөлек реакциялық пробиркалар алынады. Әр пробиркада праймер, 4 dNTP оның біреуі радиоактивті таңбаланған және бір ddNTP болады. Праймерден жаңа тізбек синтезі басталғаннан кейін ДНҚ полимераза тізбекке кездейсоқ қалыпты dNTP-тың орнына ddNTP-ты енгізеді де, тізбек ұзаруын тоқтатады. Уақыт өткен сайын ddNTP-тер барлық тізбектерге енеді де, ұзындығы әртүрлі фрагменттер түзеді. Сэнгердің дәстүрлі тәсілінде ДНҚ тізбектерінің ажыратылуы айырмашылығы бір нуклеотид болатын фрагменттерді ажырата алатын жіңішке полиакриламидті гелде жасалады. Авторадиограммадан алынған тізбек төменнен жоғары қарай оқылады.

2 Сэнгер әдісі