Генетическая инженерия презентация

Генетическая инженерия

АЛГОРИТМ РАБОТЫ (анализ последовательности) Провести BLAST целевой последовательности Определить гомологов Определить потенциальную функцию белка Дать статистическую оценку найденным гомологам

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

Форматы файлов, используемых в биоинформатике FASTA >roa1_drome Rea guano receptor type III >> 0.1 MVNSNQNQNGNSNGHDDDFPQDSITEPEHMRKLFIGGLDYRTTDENLKAHEKWGNIVDVVVMKDPRTKRSRGFGFITYSHSSMIDEAQKSRPHKIDGRVEPKRAVPRQDIDSPNAGATVKKLFVGALKDDHDEQSIRDYFQHFGNIVDNIVIDKETGKKRGFAFVEFDDYDPVDKVVLQKQHQLNGKMVDVKKALPKNDQQGGGGGRGGPGGRAGGNRGNMGGGNYGNQNGGGNWNNGGNNWGNNRGNDNWGNNSFGGGGGGGGGYGGGNNSWGNNNPWDNGNGGGNFGGGGNNWNGGNDFGGYQQNYGGGPQRGGGNFNNNRMQPYQGGGGFKAGGGNQGNYGNNQGFNNGGNNRRY >roa2_drome Rea guano ligand MVNSNQNQNGNSNGHDDDFPQDSITEPEHMRKLFIGGLDYRTTDENLKAHEKWGNIVDVVVMKDPTSTSTSTSTSTSTSTSTMIDEAQKSRPHKIDGRVEPKRAVPRQDIDSPNAGATVKKLFVGALKDDHDEQSIRDYFQHLLLLLLLDLLLLDLLLLDLLLFVEFDDYDPVDKVVLQK QHQLNGKMVDVKKALPKNDQQGGGGGRGGPGGRAGGNRGNMGGGNYGNQNGGGNWNNGGNNWGNNRGNDNWGNNSFGGGGGGGGGYGGGNNSWGNNNPWDNGNGGGNFGGGGNNWNGGNDFGGYQQNYGGGPQRGGGNFNNNRMQPYQGGGGFKAGGGNQGNYGNNQGFNNGGNNRRY

АЛГОРИТМ РАБОТЫ (анализ последовательности) Поиск в базах данных всей известной информации: http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi

Дополнительный анализ последовательности http://www.bioinformatics.org/sms2/

Анализ белкового продукта гена

АЛГОРИТМ РАБОТЫ НАЙТИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ САЙТОВ В ПОЛИЛИНКЕРЕ ВЕКТОРА. ПРОВЕСТИ ПОИСК ЭТИХ САЙТОВ В ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА. ВЫБРАТЬ САЙТЫ В ПОЛИЛИНКЕРЕ ВЕКТОРА ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА(ВЫБИРАЮТ ТЕ, КОТОРЫХ НЕТ В ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА). Учитывать направление промотора!!! ПОДОБРАТЬ ПРАЙМЕРЫ К ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА (ПРЯМОЙ И ОБРАТНЫЙ). ВВЕСТИ В СОСТАВ ПРАЙМЕРОВ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ВЫБРАННЫХ САЙТОВ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ. СОСТАВИТЬ СХЕМУ КЛОНИРОВАНИЯ ЦЕЛЕВОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ В ВЕКТОР.

Вектора – что нужно учитывать

Где промотор – начало гена должно быть ориентировано к концу промотора

Где промотор – начало гена должно быть ориентировано к концу промотора

Где промотор – начало гена должно быть ориентировано к концу промотора

Где промотор – начало гена должно быть ориентировано к концу промотора

Область полилинкера –

Область полилинкера

Область полилинкера

Область полилинкера

1 этап НАЙТИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ САЙТОВ В ПОЛИЛИНКЕРЕ ВЕКТОРА. Bioinformatics.org/SMS/

Область полилинкера вектора

АЛГОРИТМ РАБОТЫ ПРОВЕСТИ ПОИСК ЭТИХ САЙТОВ В ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА. Bioinformatics.org/SMS/

Последовательность целевого гена Atgactgccacgattcccccgttgacaccaacggtaacgcccagcaatcccgatcgcccgattgcggatctcaaactacaagacatcattaaaaccctgcccaaggaatgcttcgagaaaaaagcgagcaaagcctgggcttctgttttgattaccctaggggcgatcgccgtgggctatttgggcattatttatctgccctggtactgcttgcccattacctggatctggacagggacagccttaacgggggccttcgttgtcggccatgactgtggccatcgctcctttgctaaaaaacgctgggtcaatgatttagtgggacatatcgcttttgctcccctcatctaccctttccatagctggcgcctactccacgaccaccatcacctccacaccaacaaaattgaggttgataacgcctgggatccctggagtgtggaagctttccaagccagcccggcgatcgtccggcttttttatcgggccatccggggtcccttctggtggactggttccattttccattggagcttaatgcacttcaaactttccaactttgcccaaagggaccgcaataaagtcaaattatccattgccgttgtcttcctgtttgcggcgatcgcctttcctgccctaattatcaccacaggggtgtggggtttcgtcaaattttggctaatgccctggttggtgtatcacttttggatgagcacttttaccattgtgcaccacaccattcccgaaattcgtttccgtcccgccgccgattggagtgccgccgaagcccagttaaatggtactgttcactgcgattatccccgttgggtggaagtgctctgccatgacatcaacgtccatattccccaccacctctccgttgccatcccttcctataacctacgactagcccacggaagtttaaaagaaaactggggaccttttctttacgagcgcacctttaactggcaattaatgcaacaaattagtgggcaatgtcatttatatgaccccgaacatggctaccgcaccttcggctccctgaaaaaagtttaa

Сайты в последовательности целевого гена

Анализ сайтов рестрикции

Сайты в последовательности целевого гена

АЛГОРИТМ РАБОТЫ ВЫБРАТЬ САЙТЫ В ПОЛИЛИНКЕРЕ ВЕКТОРА ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА(ВЫБИРАЮТ ТЕ, КОТОРЫХ НЕТ В ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА).

Область полилинкера вектора

АЛГОРИТМ РАБОТЫ ПОДОБРАТЬ ПРАЙМЕРЫ К ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА (ПРЯМОЙ И ОБРАТНЫЙ). Bioinformatics.org/SMS/

Последовательность целевого гена Atgactgccacgattcccccgttgacaccaacggtaacgcccagcaatcccgatcgcccgattgcggatctcaaactacaagacatcattaaaaccctgcccaaggaatgcttcgagaaaaaagcgagcaaagcctgggcttctgttttgattaccctaggggcgatcgccgtgggctatttgggcattatttatctgccctggtactgcttgcccattacctggatctggacagggacagccttaacgggggccttcgttgtcggccatgactgtggccatcgctcctttgctaaaaaacgctgggtcaatgatttagtgggacatatcgcttttgctcccctcatctaccctttccatagctggcgcctactccacgaccaccatcacctccacaccaacaaaattgaggttgataacgcctgggatccctggagtgtggaagctttccaagccagcccggcgatcgtccggcttttttatcgggccatccggggtcccttctggtggactggttccattttccattggagcttaatgcacttcaaactttccaactttgcccaaagggaccgcaataaagtcaaattatccattgccgttgtcttcctgtttgcggcgatcgcctttcctgccctaattatcaccacaggggtgtggggtttcgtcaaattttggctaatgccctggttggtgtatcacttttggatgagcacttttaccattgtgcaccacaccattcccgaaattcgtttccgtcccgccgccgattggagtgccgccgaagcccagttaaatggtactgttcactgcgattatccccgttgggtggaagtgctctgccatgacatcaacgtccatattccccaccacctctccgttgccatcccttcctataacctacgactagcccacggaagtttaaaagaaaactggggaccttttctttacgagcgcacctttaactggcaattaatgcaacaaattagtgggcaatgtcatttatatgaccccgaacatggctaccgcaccttcggctccctgaaaaaagtttaa

Подбор праймеров 5’- Atgactgccacgattcc…………-----……………………………………………………cgcaccttcggctccctgaaaaaagtttaa – 3’ Прямой праймер – такой же как последовательность в 5’ области целевого гена. Почему?

Подбор праймеров 5’- Atg act gcc acg att cc…………----- 3’ Tac tga cgg tgc taa gg (комплементарная цепь) …………………………………………………… ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’ gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’ Прямой праймер – «садится» на комплементарную цепь (3’ – 5’), следовательно, его последовательность совпадает. В нашем случае: 5’- atg act gcc acg att cc – 3’

Подбор праймеров 5’- Atgactgccacgattcc…………-----……………………………………………………cgcaccttcggctccctgaaaaaagtttaa – 3’ Обратный праймер – пишется с учетом правила комплементарности. Почему?

Подбор праймеров 5’- Atg act gcc acg att cc…………----- 3’ Tac tga cgg tgc taa gg (комплементарная цепь) …………………………………………………… ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’ gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’ Обратный праймер – «садится» на первую цепь (3’ – 5’), следовательно, его последовательность должна быть ей комплементарна. В нашем случае – 3’- gag gga ctt ttt tca aat t – 5’ При заказе на синтез – праймер «переворачивают и пишут следующим образом: 5’- t taa act ttt ttc agg gag - 3’

Прямое клонирование Сайты рестрикции можно ввести в 5’-область праймера Провести ПЦР Сделать гидролиз ПЦР-продукта и вектора соответствующими эндонуклеазами рестрикции Провести лигирование целевого фрагмента и вектора

АЛГОРИТМ РАБОТЫ ВВЕСТИ В СОСТАВ ПРАЙМЕРОВ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ВЫБРАННЫХ САЙТОВ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ. Были выбраны сайты для SphI – GCA TGC и SmaI – CCC GGG

Область полилинкера вектора

Введение сайтов рестрикции в праймеры 5’- Atg act gcc acg att cc…………----- 3’ Tac tga cgg tgc taa gg (комплементарная цепь) …………………………………………………… ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’ gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’ Прямой праймер: 5’- atc gat gca tgc atg act gcc acg att cc – 3’ SphI – GCA TGC Обратный праймер: 5’- aca ttc ccc ggg t taa act ttt ttc agg gag - 3’ SmaI – CCC GGG

Расчет температуры отжига праймеров (A+T)*2+(C+G)*4 (для праймеров до 20-25 п.н.) Для праймеров большей длины более сложное: 22+1,46(2*(G+C) +(A+T)) Прямой праймер: 5’- atc gat gca tgc atg act gcc acg att cc – 3’ (14)*2+(15)*4= 88 градусов Обратный праймер: 5’- aca ttc ccc ggg t taa act ttt ttc agg gag - 3’ (16)*2+(14)*4= 88 градусов

Прямое клонирование Две пары праймеров: Одна пара строго на последовательность целевого гена Прямой праймер: 5’- atg act gcc acg att ccg att– 3’ (11)*2+(10)*4= 62 градуса Обратный праймер: 5’- t taa act ttt ttc agg gag ggc - 3’ (13)*2+(9)*4= 62 градуса

Прямое клонирование Провести ПЦР с первой парой Подобрать вторую пару праймеров с введенными сайтами рестрикции (уменьшая число нуклеотидов, соответствующих целевой последовательности для оптимизации температуры отжига)

Прямое клонирование Провести ПЦР, используя ПЦР-продукт первой реакции в качестве матрицы Сделать гидролиз второго ПЦР-продукта и вектора соответствующими эндонуклеазами рестрикции Провести лигирование целевого фрагмента и вектора

Прямое клонирование Через Т-вектор (в случае использования Taq-полимеразы) Тогда сайты рестрикции можно ввести в 5’-концевую часть праймера без добавления нуклеотидов

Введение сайтов рестрикции в праймеры 5’- Atg act gcc acg att cc…………----- 3’ Tac tga cgg tgc taa gg (комплементарная цепь) …………………………………………………… ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’ gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’ Прямой праймер: 5’- atc gat gca tgc atg act gcc acg att cc – 3’ SphI – GCA TGC Обратный праймер: 5’- aca ttc ccc ggg t taa act ttt ttc agg gag - 3’ SmaI – CCC GGG

АЛГОРИТМ РАБОТЫ СОСТАВИТЬ СХЕМУ КЛОНИРОВАНИЯ ЦЕЛЕВОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ В ВЕКТОР.

Т-вектор