ИФА – иммуноферментный анализ презентация

ИФА – иммуноферментный анализ Врач интерн Шикеб С.А.

Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)  лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

Классификация.

Классификация.

Классификация.

«Твердая фазы» для ИФА пластмасса (полистирол, поливинилхлорид и др.) в виде стандартно штампованных микроплашек с 96 или 60 лунками (или шарики, колпачки и прочее - для постановки единичных проб); Белки хорошо сорбируются на подобранных для ИФА пластмассовых материалах. Все остальные реагенты тест-систем используют в виде растворов. Результат реакции «остается» на твердой фазе и регистрируется количественно.

Прямой ИФА Гомогенный (EMIT-анализ) Гетерогенный 1. конкурентный 2. ингибиторный 3.Сэндвич-анализ 4.иммуномерсентометрический

EMIT (enzyme multiplied immunoassay technique) – способ гомогенного ИФА, основанный на связи с ферментами. В основе гомогенного ИФА лежит ингибирование активности фермента при его соединении с антигеном и восстановление ее в результате реакции антиген – антитело или же, наоборот, потеря активности фермента в результате реакции. Существенным достоинством гомогенного ИФА является экспрессность определения, которая составляет 2 – 5 минут. К недостаткам следует отнести меньшую чувствительность, чем в гетерогенном ИФА (~ 1 мкг/мл).

Прямой конкурентный метод. К иммобилизованным антителам добавляют раствор, содержащий определяемое вещество и фиксированную концентрацию меченого антигена, инкубируют и после отмывки носителя от несвязавшихся компонентов регистрируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. Величина детектируемого сигнала находится в обратной зависимости от концентрации антигена.

Примером неконкурентного ИФА является «сэндвич»-метод. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации образуется комплекс антиген-антитело. Добавляют меченные ферментом специфические антитела. Ферментативная  реакция –при добавлении субстрата Определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена.

Сэндвич- метод. ELISA На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных антител, что послужило поводом для широкого распространения названия «сэндвич»-метод. метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, Сэндвич по крайней мере, две антигенные детерминанты.

Непрямой ИФА Гетерогенный 1. конкурентный 2. ингибиторный 3.Сэндвич-анализ (неконкурентный) 4.иммуномерсентометрический

СХЕМА непрямого ИФА

Непрямой «сэндвич»-метод Непрямые варианты ИФА не требуют очистки искомых антигенов или антител Вместо антивидовых антиглобулиновых антител для конъюгации с ферментом может быть использован, например, протеин А стафилококка, который по своей природе с высокой аффинностью связывается с иммуноглобулинами класса G некоторых видов млекопитающих, включая человека.

Непрямой конкурентный ИФА.

Преимущества и недостатки

Ферменты- метки в ИФА  Пероксидаза из корней хрена (субстраты: • орто-фенилендиамин (продукт желто-коричневый, растворимый, поглощает при 492 нм);•  3,3'-диаминобензидин (продукт коричневый, нерастворимый); •  3-амино-9-этилкарбазол (продукт красный; нерастворимый); •   β-Галактозидаза (субстраты - дериваты β-галактозида, например 4-метилумбелиферил-β-D-галактозин). Щелочная фосфатаза (субстраты: 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат в комбинации с голубым тетразолиевым, продукт голубой, нерастворимый; р-нитрофенил фосфат, продукт желтый, растворимый, поглощает при 405 нм). Уреаза (субстрат - мочевина в комбинации с бромкрезолом пурпурным, продукт образуется очень быстро, пурпурного цвета, растворимый, поглощает при 590 нм).

«авидинбиотиновое» взаимодействие Если по тем или иным биохимическим причинам заданный антиген или интересующее антитело не удается конъюгировать с меткой без существенных потерь в аффинности их связывания, то в конструкцию тест-системы пробуют вводить дополнительные компоненты. Авидин - белок, выделяемый из «белка» куриных яиц, биотин - витамин Н (он же кофермент R). Авидин по своей природе с высокой аффинностью (Kd ~ 10-15 M) связывает биотин. Биотин легко конъюгируется с флюоресцеином. Кроме того, и против авидина, и против биотина получены высокоаффинные моноклональные антитела. Сходным по аффинности сродством к биотину обладает также белок стрептавидин, выделяемый из грибов Streptomyces avidinii.

Преимущества и недостатки ИФА Преимущества метода ИФА: 1) Высокая специфичность и чувствительность метода ИФА (более 90%). 2) Возможность определения заболевания и отслеживания динамики процесса, то есть сравнивание количества антител в разных временных промежутках. 3) Доступность ИФА-диагностики в любом медицинском учреждении.

Недостатки ИФА: влияние фона на результат анализа, наличие в тестируемых образцах модификаторов активности ферментов (кофакторов, ингибиторов); возможность денатурации ферментов под действием внешних факторов; применение метода возможно лишь к хорошо изученным системам, где есть очищенные антигены и высокоспецифичные антитела.

Пути преодоления Для уменьшения вероятности получения ложноположительных результатов ИФА используют в сочетании с соответствующими хроматографическими подтверждающими методами. ВЕСТЕРН БЛОТТИНГ – подтверждающий метод для диагностики ВИЧ

Применение. 1) Поиск специфических антител к любому инфекционному заболеванию; 2) поиск антигенов каких-либо заболеваний (инфекционных, венерологических); 3) исследование гормонального статуса пациента; 4) обследование на онкомаркеры; 5) обследование на предмет наличия аутоиммунных заболеваний.