Изучение биохимических свойств микробов и их чувствительность к антибиотикам. Микробиологические исследования воды презентация

Куб ГАУ Куб ГАУ кафедра микробиологии, эпизоотологии и вирусологии Ведущий преподаватель доктор биологических наук, профессор Нино Нодариевна Гугушвили

Лабораторные занятия по общей микробиологии для факультета ветеринарной медицины

Тема Изучение биохимических свойств микробов и их чувствительность к антибиотикам. Микробиологические исследования воды

Задание 1. Изучить методы определения биохимических свойств культуры. Сделать посев чистой культуры на МПА с индикаторными бумажками для определения сероводорода и аммиака, посев на цветной ряд. 2. По результатам посевов на предыдущем занятии определить резистентность выделенной культуры к антибиотикам. 3. Метод глубинного посева провести микробиологический анализ воды (чистой, загрязненной и из реки Кубань) для определения общего бактериологического загрязнения (ОМЧ). 4. Ознакомиться с методами определения коли – титра, коли - индекса воды и почвы

1. Изучить методы определения биохимических свойств культуры. Сделать посев чистой культуры на МПА с индикаторными бумажками для определения сероводорода и аммиака, посев на цветной ряд. Методы определения биохимических свойств 1. Сахаролитические свойства Выявляют при посеве бактерийна дифференциально-диагностические среды с разными углеводами и индикаторами. Чаще применяют среды Гисса (с индикатором Андрэ, но можно использовать бромтимолблау, бромкрезолпурпур, лакмус и др.). Набор сред с разными углеводами (глюкоза, лактоза, мальтоза, сахароза, маннит, дульцит, арабиноза, сорбит и др.), стерильное обезжиренное простое молоко, молоко с лакмусом, молоко с метиленовым синим – называют пестрым рядом.

Посевы культур осуществляют по общепринятой методике бактериологической петлёй или Пастеровской пипеткой. После инкубирования в термостате учитывают результат ферментации углеводов: изменение цвета питательной среды (в красный цвет при индикаторе Андредэ) означает расщепление углевода и образование в среде кислых продуктов распада. Если при расщеплении углевода образуется не только кислота, но и газ, происходит вытеснение поплавка пузырьками газа, скапливающимися в его верхней части.

Часто применяют полужидкие среды с углеводами и индикатором ВР (смесь водного голубого и розоловой кислоты), а так же плотные среды с углеводами и индикаторами (агар Эндо, агар Левина, Плоскирева). Протеолитические способности микроорганизмов Исследуемую культуру засевают на МПЖ, простое молоко, иногда пользуются свёрнутой кровяной сывороткой лошади, коагулированным белком куриного яйца.

Посев микробов в застывшую столбиком МПЖ Производят уколом, погружая иглу (или петлю) с исследуемой культурой в глубь питательной среды до дна пробирки. Посевы с микробами, обладающими способностью расти при 20-220, оставляют при комнатной температуре, остальные посевы инкубируют в термостате. В случае разжижения МПЖ чтобы исключить влияние тепла, пробирки остужают под струёй водопроводной воды. В тех пробирках, где под действием ферментов бактерий произойдёт протеолиз желатина, среда разжижается. Микробы различных видов разжижают желтаин неодинаково.

Способность микроорганизмов гидролизовать казеин Определяют на молочном агаре Эйкмана: к 10 мл. стерильно расплавленного на водяной бане МПА добавляют 3 мл стерильного обезжиренного молока и смешивают, разливают в чашки Петри, остужают. Посев осуществляют петлёй и шпателем по всей поверхности среды, чтобы получить изолированные колонии. Выдерживают в термостате 24-48 часов. Вокруг колоний образуется чёткая зона просветления молочного агара. При посеве в молоко протеолиз выражается просветлением столбика молока, появлением рыхлого или слизистого осадка на дне пробирки.

Степень протеолиза Степень протеолиза и глубину расщепления белка у разных видов бактерий определяют по образованию конечных продуктов распада (индол, сероводород, аммиак и др.). Индол: Устанавливают различными методами. Наиболее доступным и удобным считается метод с использованием индикаторных бумажек, приготовленных по определенному рецепту. Фильтровальную бумагу пропитывают горячим насыщенным водным 12%-ным раствором щавелевой кислоты, высушивают на воздухе, разрезают на полоски (10х0,5 см.) и хранят в стеклянной банке с притёртой пробкой. Чтобы выявить

Чтобы выявить образование индола, исследуемую культуру бактерий засевают в пробирку с МПБ или бульоном Хоттингера, куда вставляют индикаторную бумажку, прижимая её конец ватной пробкой (нижний край бумажки не должен касаться питательной среды). Выдерживают в термостате при 37оС 1-3 дня. При наличии индолообразования нижняя часть индикаторной бумажки окрашивается в розовый цвет (просматривать при проходящем свете).

Определение сероводорода Определение сероводорода в жидкой среде основано на почернении полоски фильтровальной бумажки, пропитанной 10%-ным раствором уксуснокислого свинца (образуется сернистый свинец черного цвета). Определение аммиака В пробирке с засеянной бактериальной культурой закрепляют между стенкой пробирки и пробкой розовую лакмусовую бумажку, которая в присутствие аммиака синеет.

Редуцирующие свойства Определяют на основании изменения цвета органической краски (метиленовой сини, малахитовой зелени, нейтрального красного и др.), внесённой в питательную среду (часто в молоко). Петлю исследуемой культуры высевают в среду с краской, инкубируют в термостате 24 ч. Под действием микробных ферментов краситель восстанавливается, происходит его обесцвечивание или изменение первоначального цвета.

Редукция нитратов (денитрификация) Восстановление соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты), а затем в аммиак и свободный азот, определяют посевом на специальную среду (МПБ с добавлением 2%-го азотнокислого калия, свободного от нитритов) исследуемой бактериальной культуры и через 48-72 ч. культивирования в термостате при 37-38оС добавляют 1 мл. реактива, содержащего в определённых пропорциях йодистый калий и 10%-ную серную кислоту. При редукции нитратов в нитриты среда окрашивается в тёмно-синий цвет.

Определение каталазы Осуществляют разными способами. На предметное стекло наносят каплю 3-10%-го раствора перекиси водорода и вносят в неё петлю бактериальной агаровой культуры. Выделение пузырьков газа (кислорода) свидетельствует о наличии у микробов каталазы.

РИСУНОК КОСТЕНКО СТР.77

2. По результатам посевов на предыдущем занятии определить резистентность выделенной культуры к антибиотикам Чашки Петри с дисками антибиотиков и выросшими колониями микроорганизмов извлекают из термостата и исследуют степень чувствительности отдельных культур микроорганизмов к антибиотикам. Для этого в лабораторный журнал записывают названия антибиотика и значение диаметра зоны (мм) задержки роста микробов вокруг диска, соответствующего данному антибиотику. В том случае, если задержки роста нет, т.е. микроорганизмы устойчивы (резистентны) к антибиотику, диффундирующему в агар, диаметр зоны задержки роста равен нулю. Измерения проводят с помощью линейки со дна чашки Петри.

Результаты определения чувствительности бактерий к антибиотикам

3. Метод глубинного посева провести микробиологический анализ воды (чистой, загрязненной и из реки Кубань) для определения общего бактериологического загрязнения (ОМЧ) Количество микроорганизмов в 1 г почвы или 1 мл воды рассчитывают по формуле:

Они должны удовлетворять следующим требованиям: - выделяться в окружающую среду в больших количествах человеком или теплокровными животными; - не размножаться в окружающей среде; выживать в окружающей среде в течение сроков, близких к выживанию патогенных форм; быть достаточно легко идентифицируемы.

Таким требованиям отвечают популяции кишечной палочки – Escherichia coli и ряда других бактерий и вирусов (Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Streptococcus faecalis, Str. faecium, энтеровирусы и др.). Представители родов Escherichia Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella относят к бактериям группы кишечной палочки (БГКП).

Микробиологические показатели загрязненности воды

Методы определения коли-титра Существуют два метода: метод бродильной пробы и метод мембранных фильтров. Метод бродильной пробы: Сущность бродильной пробы заключается в том, что исследуемую воду в определённых количествах высевают на среду накопления. Затем при наличии роста, характерного для кишечной палочки, пересевают на дифференциально-диагностические среды.

Показатели чистоты почв по СПМ

Титр микроорганизмов – наименьшая масса почвы (г), содержащая 1 клетку указанной группы микроорганизмов. Присутствие в почве кишечной палочки и термофильных микроорганизмов свидетельствует о достаточно свежем фекальном загрязнении, тогда как споры клостридий, сохраняясь, длительное время в почве, могут свидетельствовать о давнем ее загрязнении. Рост плотности нитрифицирующих бактерий свидетельствует о протекании процессов самоочищения почвы и более полной минерализации органических субстратов.

Благодарю за внимание!