Капиллярный электрофорез и электрохроматография Аналитический Центр химического презентация

История и этапы развития метода Электрофорез – движение заряженных частиц растворе под действием электрического поля История: Начало 19-го века – открытие электрофореза 1937 – Нобелевская премия (Тизелиус) 1981-1983 – первые аналитические приборы капиллярного электрофореза (Джоргенсон, Лукас) 1990-2003 Расшифровка генома человека

Скорость миграции по капилляру

Эффективность в электрофорезе не зависит от длины капилляра!

Строение капилляра Трубка из плавленного кварца со строго фиксированными диаметрами. Внешний диаметр 375 мкм, внутренний – от 20 до 100 мкм (50, 75 мкм) Длина 20 - 100 см Покрытие полиимидной пленкой В месте детектирования покрытие удалено (окно детектирования)

Профиль гидродинамического и электроосмотического потоков Электроосмотический Плоский профиль Минимизируется размывание зон Зависит от свойств поверхности капилляра Гидродинамический Параболический профиль Большее размывание зоны Не зависит от свойств поверхности

Выделение тепла капилляром Капилляр работает как сопротивление Чем больше ток, тем больше выделение тепла Зависимость силы тока от напряжения нелинейна Чем меньше диаметр капилляра, тем меньше ток Чем концентрация буферного электролита, тем меньше ток Желателен ток до <60 мA ( < 1 W)

Ввод пробы в капилляр Гидродинамический Давление Вакуум Гидростатический Электрокинетический

Детектирование в капиллярном электрофорезе Капилляр имеет малый объем, следовательно объем вводимой пробы очень мал (нанолитры) Специальные приемы по минимизации мертвого объема Должна быть решена проблема высокого напряжения при анализе Обычно используемые детекторы UV/Vis – наиболее распространен LIF (laser-induced fluorescence) - наиболее чувствителен Mass spectrometry – наиболее перспективен Бесконтактная кондуктометрия

Пределы обнаружения

Оптимизация в капиллярном электрофорезе pH Первое, что надо варьировать Влияет на ЭОП и подвижность (заряд) Органический растворитель Сольватация веществ Концентрация и природа добавок образование мицелл, ионных пар и т.п. Неводный электрофорез Сольватация, заряд (но проблемы с током !) Температура, напряжение Сольватация, хим. равновесие, подвижность

Достоинства капиллярного электрофореза Очень высокая эффективность (до 6 млн. тт)     Требуемый объем пробы (1-10 мкл) Быстрое разделение (1 - 30 мин) Предсказуемая селективность Автоматизация «Ненужные» компоненты матрицы пробы можно легко удалить из капилляра промывкой Капилляр легко заменить Совместимость с масс-селективным детектором

Недостатки капиллярного электрофореза Часто недостаточная чувствительность Хуже воспроизводимость по сравнению с хроматографией Сложно контролировать величину ЭОП Свойства капилляров могут меняться от партии к партии Узкий динамический диапазон (1 порядок концентраций) Образование пузырьков газа в капилляре Форма пиков часто несимметрична

Основные виды электрофореза Капиллярный зонный электрофорез (CZE) Мицеллярная электрокинетическая хроматография (MEKC) Микроэмульсионная электрокинетическая хроматография (MEEKC) Капиллярная электрохроматография с заполненными капиллярами (CEC) Капиллярный гель-электрофорез (CGE) Изотахофорез (ITP) Капиллярная изоэлектрическая фокусировка (CIEF)

Капиллярный зонный электрофорез

Схема удерживания ионов в капиллярах

Порядок миграции ионов в кварцевых капиллярах

Принцип образования полиэлектролитных комплексов

Схема удерживания анионов в модифицированных капиллярах

Порядок миграции ионов в модифицированных кварцевых капиллярах

Определение инициаторов взрывчатых веществ Модификатор: 2,4-ионен

Определение азида в пробе с места взрыва

Анализ лекарственных композиций

Структура 2,10-ионена

Мицеллярная электрокинетическая хроматография

Два механизма разделения Два механизма разделения Электрофоретическая подвижность в свободном растворе электролита Распределение между аналитом и мицеллами Мицеллы Образуются в растворах при концентрации ПАВ выше ККМ Имеют заряженную поверхность и гидрофобное ядро Додецилсульфат натрия (SDS) наиболее распространен (ККМ ~ 15 мМ).

Порядок миграции веществ в МЕКС

Факторы, влияющие на селективность в МЕКС Природа ПАВ Длина гидрофобного «хвоста» и природа гидрофильных ионогенных групп Различное агрегатное число (SDS = 16) Желчные кислоты Катионные ПАВ обращают направление ЭОП рК ионогенных групп Буферный электролит Добавки органических растворителей имеют большее влияние, чем в КЗЭ. Большое кол-во орг. растворителей разрушает мицеллы рН и рК аналитов Температура Сильное влияние на устойчивость и поведение мицелл Необходимо тщательное термостатирование (2ºC критично)

Схема удерживания анионов в МEKC

Определение DNS-производных аминокислот

Микроэмульсионная электрокинетическая хроматография

Принципы метода МEEKC

Эмульсия масло-вода

Капиллярный гель-электрофорез

Особенности СGE Разделение основано на эксклюзии ЭОП подавлен или изменен Капилляры заполнены полимером Линейный полиакриламид Сшитые полимеры (3-х мерная структура) Смеси полимеров Целесообразен для больших молекул с подобными соотношениями m/z ДНК Белки

Механизм CGE Разделяемые вещества движутся по капилляру в зависимости от собственной подвижности и способности проникать в гель. Малые молекулы мигрируют первыми Большие молекулы мигрируют последними pH буферного электролита Необходимо ионизовать аналиты Оставить поверхность капилляра незаряженной ( нет ЭОП)

Разделение пептидов (с флуоресцентной меткой) методом CGE

Капиллярная электрохроматография в заполненных капиллярах

Теоретические предпосылки о преимуществах СЕС Плоский профиль потока подвижной фазы Размер частиц сорбента Нет ограничений по давлению Используют частицы размером < 1.5 мкм Экспрессность анализа Большая поверхность приводит к коротким колонкам Хорошо стыкуется с MS (можно использовать большие концентрации орг. растворителей для управления селективностью)

Электрофореграммы ароматических кислот в вариантах КЗЭ (A) и СЕС (Б)

Схема выбора метода электрофореза

Электрофорез на микрочипе

Схема производства микрочипа

Основное преимущество микрочипового электрофореза - экспрессность