Методы создания компетентных клеток презентация

Методы создания компетентных клеток Лабораторная работа №9 по «Генетике микроорганизмов»

План: Определение компетентности Химические методы Физические методы

Определение Компетентностью при генетической трансформации обычно называется способность бактериальных клеток адсорбировать и поглощать чужеродную ДНК. У многих видов бактерий компетентность возникает лишь на определенном этапе роста культуры. Например, культуры стафилококков находятся в стадии компетентности в ранней логарифмической фазе роста. Культуры бактерий Bacillus subtilis находятся в стадии компетентности на более поздних этапах экспоненциального роста, гемофильные бактерии – в стационарной фазе роста. У некоторых бактерий клетки компетентны в любой фазе роста (например, у гонококков и менингококков). Установлено, что в компетентных культурах стрептококков, гемофильных бактерий к трансформации способна почти каждая клетка. В то же время у B. subtilis в этих же условиях ДНК могут поглощать только 10–15 % клеток популяции, у Aspergillus niger – 0,1–0,2 %, у Rhizobium japonicum – до 0,1 % клеток всей популяции.

Определение В ряде научных лабораторий было показано, что состояние компетентности можно передать от компетентных клеток некомпетентным посредством фильтратов суспензий бактериальных культур, следовательно существует какой-то внеклеточный фактор, обеспечивающий состояние компетентности. Хотя естественная трансформация описана более чем у 50 видов бактерий, факторы компетентности известны лишь у стрептококков и бацилл. Возможно, что у некоторых видов они еще просто не обнаружены; однако можно считать установленным, что трансформация у таких хорошо изученных микроорганизмов, как гонококки и менингококки, осуществляется без факторов. Это вполне объяснимо, так как клетки гонококков и менингококков способны к трансформации в любой стадии роста культуры: компетентность является их постоянным свойством.

Определение Компетентные клетки у различных видов бактерий отличаются от некомпетентных не только способностью к поглощению ДНК, но и другими свойствами: • обладают сниженным уровнем метаболизма; • более устойчивы к пенициллину, чем остальные клетки в популяции; • сниженным темпом репликации ДНК или вообще ее отсутствием; • меньшими размерами, чем некомпетентные; • изменением наружных слоев, наличием обнаженных участков цитоплазматической мембраны; • повышенной чувствительностью к осмотическому шоку, тепловой обработке; • сниженным поверхностным зарядом. Однако существует много видов бактерий, у которых отсутствует естественная компетентность. Примером таких бактерий являются E. coli, бактерии рода Erwinia и другие, но несмотря на это, они также могут быть трансформированы. 

Химические методы

Физические методы Широко используется также способ индукции компетентности за счет глубокого замораживания с последующим оттаиванием клеток. При этом осуществляется трансформация как хромосомной, так и плазмидной ДНК. Такой способ трансформации получил название криотрансформации. Чтобы получить трансформанты с помощью этого метода, смесь реципиентных клеток и ДНК донора в присутствии криопротектора (0,5 % раствора твина-80) замораживают (до –196 ºС), а затем отогревают при +42 ºС и высевают на селективные среды, позволяющие отобрать трансформанты.

Физические методы Механизмы индукции компетентности изучены недостаточно. Показано, что высокие концентрации ионов кальция и других щелочно-земельных металлов вызывают структурную реорганизацию клеточных мембран, а также плазмолиз. В мембранах обнаруживаются полиморфные структурные изменения, образуются участки соединения и слияния мембран. При этом усиливается мембранная проницаемость, увеличиваются размеры периплазматического пространства. В связи с этим предполагается, что ДНК поступает в цитоплазму за счет дефектов в мембранах, а также в участках их слияния. Возможно, что аналогичные изменения возникают в клетках и под влиянием других воздействий, индуцирующих компетентность. Высказывается предположение, что в процессе замораживания-оттаивания молекулы ДНК поступают в цитоплазму путем диффузии через временные быстро репарируемые дефекты мембран.

Физические методы В последнее время трансформацию успешно осуществляют с помощью электропорации. Существуют специальные приборы – электропораторы, которые за счет кратковременного воздействия (обычно 5–20 мс) электрического поля высокой напряженности (1–15 кВ/см) на клеточную мембрану приводят к образованию в ней пор (электропробой). Время существования и размер пор достаточны, чтобы такие макромолекулы, как ДНК, могли из внешней среды войти в клетку в результате действия осмотических сил. Объем клетки при этом увеличивается. Напряженность электрического поля и продолжительность его действия, концентрации трансформирующей ДНК и клеток-реципиентов для каждой системы клеток подбирают экспериментально.