Набор реагентов для исследования биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР в режиме реального времени Фемофлор. презентация

Введение До недавнего времени существовали значительные ограничения в изучении микробиологических сообществ. Главные из них: недостаточная дискриминация микроорганизмов по морфологическим признакам; cложности в культивировании большинства микроорганизмов. Внедрение молекулярно-биологических методов позволило открыть большое число новых микроорганизмов, расширить, упорядочить, а в некоторых случаях пересмотреть знания о таксономии. По современным оценкам более 90% микроорганизмов окружающей среды ранее не могли быть культивированы и идентифицированы. В случае биоценоза кишечника эта цифра составляет более 60%. Вагинальный биоценоз представляет собой сложную сбалансированную систему. Учитывая его влияние на протекание и исход беременности и на инфицированность верхнего отдела урогенитального тракта, изучение вагинального биоценоза, его состава и принципы регуляции и восстановления в норме и при патологиях представляет собой крайне важную задачу.

Вагинальная экосистема (биоценоз) У здоровых женщин вагинальная экосистема хорошо сбалансирована и стабильна. В 1 мл вагинальной жидкости в среднем содержится около 109 бактерий (CFU - колоний образующих единиц). В норме основным компонентом вагинального биоценоза являются лактобактерии. Они участвуют в метаболизме гликогена, который эксклюзивно вырабатывается клетками вагинального эпителия, превращая его в молочную кислоту и приводя к закислению – в норме pH 3,8 – 4,5. Кислый pH в сочетании с выработкой бактериоцина (bacteriocin) и перекиси водорода создает защиту, препятствующую колонизации урогенитального тракта женщин другими микроорганизмами. Кроме лактобактерий в норме могут присутствовать другие микроорганизмы, например Staphylococci, group B Streptococci, Corynebacterium, Prevotella, Peptostreptococcus, Gardnerella, Enteric bacteria и другие, причём похоже, что существуют их устойчивые сочетания. В норме количество этих микроорганизмов составляет около 104 -107 CFU/ml.

Нарушения вагинального биоценоза Нарушения вагинального биоценоза связаны с вагинитами и вагинозами. Устойчивость биоценоза к воздействиям обусловлены: генетическими факторами связанными с функционированием иммунной системы, прежде всего врожденного иммунитета; составом биоценоза (вагинальной микрофлоры); внешние факторы (LifeStyle)

Баквагиноз причина Причина возникновения не ясна. Считается, что из-за снижения количества лактобактерий, но почему оно снижается? При снижении количества лактобактерий возникает «замкнутый круг»:

Баквагиноз лечение До 80-х преобладало мнение, что баквагиноз не болезнь, а «неприятность» и в большинстве случаев специфическое лечение не назначалось. С 80-х из-за различных осложнений «на всякий случай» стали лечить антибиотиками против анаэробов – metranidazole и clinamycine (рекомендованы Центром Контроля Болезней, CDC). Стандартное лечение метранидазолом и клинамицином в течение недели помогает в 80-90% случаев. Однако, в течение трех месяцев в 15-30% случаев рецидивирует, так называемый рецидивирующий баквагиноз. Проблема не в том, как убрать «плохие» бактерии, а в том как восстановить нормальный биоценоз.

Как задача постановки диагноза врачом решается сейчас Врач Осмотр Жалобы Микроскопия неокрашенного мазка Лаборатория Посев на флору Микроскопия окрашенных мазков По Граму Метиленовым синим ПЦР Качественная оценка условных патогенов

Сравнение мазок-посев (по данным собственных исследований)

Недостатки существующего подхода Посев на флору Длительные сроки культивирования, повышенные требования к транспортировке и хранению материала Не все типы микроорганизмов растут равномерно – в процессе роста теряется соотношение между ними Ограниченный спектр выявляемых микроорганизмов Отсутствие возможности культивирования большинства анаэробов Повышенные требования к лаборатории Микроскопия мазка Субъективность оценки (изменчивость микроорганизмов, необходимость диагностировать много морфотипов) Не все микроорганизмы видны в световой микроскоп Как следствие - ограниченный спектр выявляемых микроорганизмов Невозможность сопоставить результаты Приблизительная количественная оценка ПЦР качественными методами Не дает представления о соотношении микроорганизмов между собой Ограниченный спектр выявляемых микроорганизмов Нет количественной оценки

Проблемы диагностики заболеваний, связанных с условными патогенами Существующие в настоящее время подходы к диагностике условно-патогенной флоры не всегда информативны для врача, т.к. Не дают представления о соотношении микроорганизмов, составляющих биоценоз, между собой Выявляют ограниченный спектр микроорганизмов Не дают количественной оценки

Чего мы хотим ? Диагностика баквагиноза или оценка биоценоза? Диагностика баквагиноза – «кто победил, хорошие или плохие?». Ответ типа «Да/Нет» - есть БВ или нет. Оценка биоценоза – количественная характеристика состава «хороших» и «плохих», оценка их «сил», устойчивости биоценоза.

Относительный количественный анализ: Анализ условно патогенной флоры

Анализ условно-патогенных микроорганизмов Врачу необходима информация о состоянии биоценоза в целом: Информация о соотношении общей обсемененности урогенитального тракта, лактобактерий и различных групп микроорганизмов является ключевой при оценке состояния биоценоза и, как следствие, состояния пациентки Важна количественная оценка групп микроорганизмов, что позволит оценивать динамические изменения состояния биоценоза

Подход к разработке диагностической системы По литературным данным более 100 различных видов микроорганизмов могут входить в состав биоценоза урогенитального тракта у женщин. Эти микроорганизмы можно сгруппировать по признаку генетического родства. Для выявления этих групп и были разработаны реагенты.

Что такое Фемофлор? Высококлассный метод для исследования урогенитального тракта у женщин, позволяющий анализировать состояние биоценоза в целом, оценивать соотношение микроорганизмов между собой. Многофакторный (23 группы микроорганизмов, общая бактериальная масса, контроль взятия материала. Итого: 25 показателей) Уникальный по составу выявляемых микроорганизмов Количественный Точный Высокая аналитическая чувствительность Высокая аналитическая специфичность Наглядный (ПО + выдача результатов) Быстрый и несложный в использовании (стандартные методики выделения ДНК и ПЦР амплификации) Наличие готовых файлов с программами для ДТ-96 – исключение ошибок и потери времени при программировании амплификатора

Состав комплектов реагентов Комплект реагентов позволяет количественно выявлять следующие группы показателей: Общую бактериальную массу Лактобактерии Аэробные микроорганизмы (факультативные анаэробы) Анаэробные микроорганизмы Микоплазмы Грибы Контроль взятия материала Контроль прохождения реакции

Фемофлор Получены патенты на изобретение №2008 105 063 от 13.02.2008 «Способ диагностики дисбаланса микробиоты различных биотопов человека и степени его выраженности» №2008 118 641 от 14.05.2008 «Способ диагностики инфекционно-воспалительных урогенитальных заболеваний у женщин» РУ ФСР 2009/04663

Состав комплектов реагентов

Назначение комплектов реагентов (1) Фемофлор 16 Расширенная этиологическая диагностика условно-патогенной и нормофлоры (23 группы микроорганизмов) Количественная оценка общей бактериальной массы Количественная оценка лактобактерий (нормофлоры) Контроль взятия биологического материала Оценка эффективности проведенного лечения Подробный мониторинг восстановления нормоценоза

Назначение комплектов реагентов (2) Фемофлор 4 Диагностика наиболее распространенных микроорганизмов условно-патогенной флоры – 5 групп микроорганизмов Количественная оценка общей бактериальной массы и лактобактерий Контроль взятия биологического материала Контроль проведенного лечения Фемофлор 8 Расширенная диагностика микроорганизмов условно-патогенной флоры (9 групп микроорганизмов) Количественная оценка общей бактериальной массы и лактобактерий Контроль взятия биологического материала Контроль проведенного лечения

Количественное исследование В случае исследования биоценозов урогенитального тракта у женщин определяется количество микроорганизмов в транспортной среде, пропорциональное общей обсемененности соответствующего биотопа. Для исключения ложноотрицательных результатов предусмотрен контроль взятия материала. Интерпретации подлежат результаты со значением контроля взятия материала более 104 (4 Log). При КВМ менее 104 (4 Log) необходимо связаться с врачом для выяснения состояния пациента или дополнительно взять материал.

Контроль взятия материала Зависимость количества взятого материала от врача Синими и красными ромбами обозначены образцы, взятые разными врачами КВМ (контроль взятия материала)

Возможности настройки системы выдачи результатов Изменение уровня отсечки ( Log) Возможность анализировать результаты по отдельным группам организмов, выставляя индивидуальный уровень отсечки для каждого из них

Инновационность предлагаемого подхода (1): Чувствительный «инструмент» с возможностью настройки под решаемую задачу, обследуемую группу пациентов, конкретного врача Возможность количественной оценки различных групп микроорганизмов и выявление соотношений между ними Выявление труднокультивируемых облигатно-анаэробных грамположительных бактерий (Atopobium vaginae), облигатно-анаэробных грамотрицательных бактерий (Prevotella, Veilonella spp, Porphyromonas spp, Fusobacterium spp, Eubacterium spp, Sneathia, Leptotrichia, Megasphaera, Dialister, Lachnobacterium) Выявление групп микроорганизмов, диагностика которых методом ПЦР до сих пор не была представлена Возможность проведения динамических наблюдений Возможность проведения научных исследований (в том числе и популяционных)

Инновационность предлагаемого подхода (2): Количественное исследование всех параметров Программное обеспечение, максимально облегчающее работу врача лаборанта: отчет о проведенном исследовании выдается программой в доступной для анализа врача-клинициста форме готовый файл загрузки (Фемофлор.ini) с программой амплификации, что существенно экономит время и исключает ошибки ручного программирования прибора (ДТ-96) определение положения стрипа в термоблоке, позволяющее исправить допущенные ошибки при установке стрипов

Оборудование и программное обеспечение

Апробация реагентов прошла в следующих лабораториях: НИИ Акушерства и гинекологии им. Отта (СПБ) ЦНИИА и Г им. Кулакова (Москва) МЦ Асклепий (Владивосток) ООО МЦ АВИЦЕННА, лаборатория Авиценна Плюс (Владивосток) ГУЗ "КДЦ" МЗ Хабаровского края "Вивея" Клиника «Здоровье человека» (Благовещенск) Центр новых мед. технологий (Новосибирск) Ассоциация независимых клинико-диагностических лабораторий «Ситилаб» (Казань) УРНИИ Дерматовенерологии (Екатеринбург) ДЦ Гармония (Екатеринбург)

Дополнительные лабораторные исследования: Medicus Amicus #2, 2006, http://www.medicusamicus.com/index.php?umonth=9&action=1x856-2-4a-5a-13gx2

Исследование популяционной выборки (ПЦР, посев, мазок).

Отзывы клиентов: «У пациенток с жалобами на выделения из влагалища целесообразно проводить скрининговое исследование состояния урогенитального биоценоза методом количественной Real-Time PCR «ФЕМОФЛОР 16» «С помощью методов генодиагностики возможно выявление труднокультивируемых облигатно-анаэробных грамположительных бактерий (Atopobium vaginae), облигатно-анаэробных грамотрицательных бактерий (Prevotella, Veilonella spp, Porphyromonas spp, Fusobacterium spp, Eubacterium spp, Sneathia, Leptotrichia, Megasphera, Dialister, Lachnobacterium), мониторинг эффективности лечения» УРНИИДВ (Екатеринбург) «Тест-система Фемофлор-16 является чувствительным инструментом для исследования биоценоза влагалища беременных женщин, позволяя выявлять как выраженные отклонения от нормы, так и только намечающиеся.» ДЦ Гармония (Екатеринбург)

Примеры результатов проведенных исследований (1) Нормоценоз Состояние нормоценоза характеризуется следующими показателями: Контроль взятия материала (КВМ) >104 (4 Log) Общая бакмасса от 106 до 108 (6-8 Log) Нормофлора от 106 до 109 (6-9 Log) относительно ОБМ – от 0-до 0,5 – нормальный уровень Аэробная и анаэробная условно-патогенная флора относительно ЛБ меньше 3 – нормальный уровень Микоплазмы: Mycoplasma (hominis + genitalium) – отсутствуют; Уреаплазмы: больше 104 диагностически значимый уровень Грибы рода Candida. Менее 103 (<3 Log). диагностически незначимый уровень Нормальный биоценоз обладает свойствами устойчивости и саморегуляции.  для женщин репродуктивного возраста.

Примеры результатов проведенных исследований (2) Умеренный дисбаланс Состояние умеренного дисбаланса характеризуется следующими показателями: Контроль взятия материала (КВМ) >104 (4 Log) Общая бакмасса от 106 до 108 (6-8 Log) Нормофлора (Lactobacillus spp.) 0-0,5 относительно ОБМ – нормальный уровень Аэробная и анаэробная условно-патогенная флора Относительно ЛБ больше -1 – значительно увеличенный уровень. Микоплазмы: отсутствуют; Уреаплазмы: Ureaplasma (urealiticum + parvum) больше 104 - диагностически значимый уровень. Грибы рода Candida. Менее 103 (<3 Log). Диагностически незначимый уровень

Примеры результатов проведенных исследований (3) Выраженный дисбаланс Состояние выраженного дисбаланса характеризуется следующими показателями: Контроль взятия материала (КВМ) >104 (4 Log) Общая бакмасса может иметь нормальный, повышенный или пониженный уровень. Нормофлора (Lactobacillus spp.) – относительно ОБМ - значительно сниженный уровень Аэробная и анаэробная условно-патогенная флора отличается разнообразием микроорганизмов. Доля большей части представителей условно-патогенной микрофлоры превышает долю лактобактерий в общей бактериальной массе. Значительно повышенный уровень. Микоплазмы: Mycoplasma (hominis + genitalium) – могут присутствовать в диагностически значимых количествах. Уреаплазмы: Ureaplasma (urealiticum + parvum) могут присутствовать в диагностически значимых количествах. Грибы рода Candida. присутствие более 103 (>3 Log) – диагностически значимый уровень.

Оценка состояния биоценоза (примеры)

Возникающие в процессе работы вопросы

Выдача результатов 1

Выдача результатов 2

Выдача результатов 3

Что нам с этим делать? Думать Еще раз думать Грамотно брать материал Проводить дополнительные анализы Работать в тесном контакте с клиницистами http://www.dna-tech.ru/information/fordoctors/diagnosticsippp/

Что с этим делают другие? Исследования биоценозов урогенитального тракта женщин репродуктивного возраста Жалобы без клинических проявлений (U,V,C) Случаи несовпадения клиники и лабораторных исследований Повторные обращения после лечения Оценка эффективности ЭКО Оценка эффективности проведенного лечения Оценка восстановления нормофлоры Проблемы с невынашиванием беременности Исследования биоценозов беременных женщин Оценка объема предполагаемой терапии Исследования биоценозов женщин в менопаузе

Группы обследованных женщин Не беременные женщины репродуктивного возраста (67 пациенток в возрасте от 19 до 49 лет, 32 года) Клинически здоровые Патологические проявления Воспалительные процессы Женщины в менопаузе ( 33 пациентки в возрасте от 41 до 73 лет, 53,3 года) Физиологическая норма Сухость слизистой

Группа женщин репродуктивного возраста «Норма» Общая бак.масса 106,5 (105,7-106,8 ) ГЭ Лактобациллы 106,1 (105,4- 106,6) ГЭ Доля лактобацилл 78 (50-79)% Доля Gardnerella 0,1 (0-6,3)%

Группа женщин в менопаузе «Норма» Общая бак.масса 106,5 (105,6-107,1 ) ГЭ Лактобациллы 104,4 (101,1- 106,5) ГЭ Доля лактобацилл 3 (0-56)% Доля Gardnerella 18 (0-32)%

Что предлагаемый анализ дает врачу: Оценка биоценоза в целом Современные методы диагностики Данный анализ более информативен, т.к. позволяет проводить сравнение количества бактериальной массы с лактобактериями – определение объема назначаемой терапии Данный анализ выявляет многие микроорганизмы, которые не видны в микроскоп или не растут на питательных средах – определение этиологии инфекционного процесса Возможность проведения динамических наблюдений По сравнению с посевом на питательные среды (срок исполнения 5 дней) этот анализ гораздо быстрее - результаты могут быть получены в течение суток

Что анализ дает пациенту Полная и информативная диагностика за 1 визит к врачу Данный анализ позволит пациенту избежать избыточного лечения (гиперпрагмазии) Индивидуально подобранная терапия для каждого пациента Возможность контролировать проведенное лечение и восстановление нормальной флоры Стоимость количественного определения каждого из показателей сопоставима (или даже меньше), чем стоимость неинформативного в данном случае качественного анализа методом ПЦР

Спасибо за внимание!