Хроматофокусирование: новые подходы в концентрировании и разделении презентация

Хроматофокусирование: новые подходы в концентрировании и разделении   А.В.Иванов  

Градиенты рН Доколоночные (внешние) - Только подвижные фазы - Необходимы смесители и т.д. [пример узла установки “Waters ALC-100”, 1978 г.]

Хроматофокусирование (ХФ) Метод ионообменной хроматографии, основанный на формировании линейного градиента рН внутри колонки (L.Sluyterman; Uppsala, 1979-81) объекты: биологические биполярные соединения (белки, ферменты, и т.д.)

Техника хроматофокусирования (ХФ)

Фокусирующий эффект при разделении биполярных соединений (из книги “Хроматофокусирование полибуфером на ПБИ”, Stockholm-Uppsala, 1982)

Преимущества хроматофокусирования не требуется дополнительное оборудование (градиентный насос, система смесителей); высокая нагрузочная емкость колонок, концентрирование и разделение на одной колонке; высокая воспроизводимость градиентов (sr0,02), широкий рабочий интервал рН (до 4-5 ед.); фокусирующий эффект (для биполярных соединений)

Новые направления ХФ

1. Хроматофокусирование ионов переходных металлов Анионообменные сорбенты: PBE-94 (Pharmacia); кремнеземы (Силохром, Силасорб) с привитыми олигоэтиленаминами – En-, Dien-, Tetren-; AP- (аминопропил-) Катионообменные сорбенты: полимеры (МГЦ, ССПС и ПММА) с привитыми карбоксильными группами -СООН, -СН2СООН Удерживание ионов металлов за счет комплексообразования при более высоких рН и элюирование при плавном снижении рН в слое сорбента (концентрирование и разделение)

Комплексообразующие сорбенты для ХФ ионов металлов (впервые – нисходящие градиенты рН на карбоксильных сорбентах) [12 сорбентов]

Хроматофокусирование (ХФ) ионов металлов на анионообменных сорбентах сорбент - а) PBE-94; б) Tetren-SiO2 (колонка 300х9 мм) СР - 25 мМ Трис-HCl (pH 7,5), Э - 1:8 Полибуфер-74 (pH 3,3), 1 мл/мин Детектирование - по реакции с ПАР (540 нм)

Разделение и концентрирование ионов металлов сорбент MacroPrep 50 CM (50 мкм, 50x4,6 мм) СР: 10 мМ Трис-HCl (pH 7,5), IСР: 0,1 (NaCl) Э: 0,5 мМ лимонная к-та (pH 3,4), IЭ: 0,1 (NaCl); 1 мл/мин Детектирование: УФ (254 нм)

Концентрирование ионов переходных металлов

Техника индуцирования: введение конц. индуцирующего раствора ИР (рН2) в поток разбавленного буферного элюента Э (рН1) (K.Slais; Brno, 1992-94; А.Иванов, 1994-95)  сокращение времени в 3-4 раза

Разделение ионов металлов с индуцированным градиентом рН сорбент - а) Dien-SiO2 (100-120 мкм, 150х2 мм); б) Tetren-SiO2 ИР – 1 мл 100 мМ Na2B4O7, Э – а) 10 мМ (6-аминогексановая к-та + гистидин); 0,2 мл/мин; б) 20 мМ, Детектирование - по реакции с ПАР (540 нм)

2. Новые простые подвижные фазы для хроматофокусирования Традиционно – полиамфолитные элюенты (“полибуферы”) Преимущества: постоянная буферная емкость в широком диапазоне рН → широкий рабочий интервал рН Но: сложный синтез, высокая стоимость, низкая устойчивость к биодеградации; трудно отделять от белков и пептидов; высокий УФ-сигнал

Подходы к поиску подвижных фаз – стартовых растворов и элюентов эмпирический - экспериментальная проверка смесей кислот, оснований и амфолитов – до 20 - 25 компонентов (Hutchens, 1985-86)

2.1. Как избавиться от подъема рН на нисходящем градиенте? IЭ < IСР сорбент Tetren-SiO2 (7,5 мкм, 1 мМ/г, 250x4,6 мм) СР: 25 мМ Трис-10 мМ H2C2O4 (pH 7,5), IСР: 1 - ~0; 2 - 0,1; 3 - 1 Э: 20 мМ H2C2O4 -22 мМ Трис (pH 3,5), IЭ: ~0,05

Нисходящие градиенты рН в анионообменных колонках полифункциональные сорбенты с полиэлектролитными свойствами; элюенты с минимальным содержанием слабых оснований; IЭ < IСР

Разделение изоформ плазминогенов сорбент Tetren-SiO2 (7,5 мкм, 50x4,6 мм) СР: 25 мМ Трис-HCl (pH 7,5), IСР: 0,02 Э: 2 мМ H2C2O4 (pH 2,9), IЭ: ~0; 1 мл/мин Проба: 20 мкл лиофилизов. смеси Glu- и Lys-плазминогенов (pI 5,82 и 5,66), активность 1 мг/мл Детектирование - УФ (280 нм)

Разделение смеси металлов сорбент PBE-94 (>100 мкм, 300x9 мм) СР: 25 мМ Трис-HCl (pH 7,5), IСР: 0,05 Э: 20 мМ глутаминовая к-та (pH 3,3), 1 мл/мин Детектирование - по реакции с ПАР (540 нм)

Эффект ионной силы подвижных фаз для карбоксильных колонок сорбент Macro-Prep 50 CM (50 мкм, 50x4,6 мм) СР: 10 мМ Трис-HCl (pH 7,5), Э: 1 мМ (1) и 0,5 мМ (2) лимонная кислота (pH 3,3 - 3,5); 1 мл/мин, ионная сила подвижных фаз: 1 - 0,01; 2 - 0,1

Квази-линейные нисходящие градиенты рН в катионообменных колонках сорбенты с полиэлектролитными свойствами; слабое основание в элюенте не влияет на профиль градиента, а лишь на конечное значение рН; IЭ  IСР (~0,05 – 0,2)

2.2. Восходящие градиенты рН Мало изучены для применения в ХФ Подвижные фазы - полиамфолиты Эффект ионной силы не исследован Перспективны для разделения белков, пептидов и др. биполярных макромолекул

Выбор элюента для восходящих градиентов рН сорбент Macro-Prep 50 CM (50 мкм, 50x4,6 мм) СР: 2 мМ лимонная к-та (pH 3,3), Э (рН 7,5): 1:25 “Полибуфер” (1); 12,5 мМ Трис-HCl (2); 12,5 мМ Трис-HCl + 1 мМ лимонная к-та (3); 12,5 мМ Трис-HCl + 6 мМ лимонная к-та (4); 1 мл/мин

ХФ альбуминов с восходящим градиентом сорбент Macro-Prep 50 CM (50 мкм, 50x4,6 мм) СР: 2 мМ лимонная к-та + 1,5 мМ Трис (pH 3,3), IСР: ~0 Э: 20 мМ Трис-HCl + 5 мМ лимонная к-та (рН 7,6); 1 мл/мин; IЭ: 0,5 Проба: овальбумин (Oval.) и бычий альбумин (BSA), 0,5 мг/мл Детектирование: УФ (280 нм)

ХФ образца формиатдегидрогеназы на сорбенте низкой емкости сорбент MN (5 мкм, 50x4,6 мм) СР: 2 мМ лимонная к-та (pH 3,0), IСР: 0,05 (NaCl) Э: 10 мМ Трис-лимонная к-та (рН 7,5); 1 мл/мин; IЭ: ~0 Проба: ФДГ из клеточного лизата с активностью 1 мг/мл Детектирование: УФ (280 нм)

Квази-линейные восходящие градиенты рН в карбоксильных колонках 1. сорбенты с высокой емкостью: слабое основание в стартовом растворе влияет на начальный участок градиента рН; IЭ > IСР ( от 0,1) 2. сорбенты с низкой емкостью: слабое основание в стартовом растворе не влияет на начальный участок градиента рН; IЭ < IСР либо IЭ  IСР (~0,05)

3. Хроматофокусирование пептидов на сульфокатионитах Возможность разделения пептидов Проблема: полиамфолитные элюенты осложняют детектирование ( < 220 нм) – только “ароматика” Отсутствие буферной емкости сорбента Исключительная роль элюента Сильно- и слабоудерживаемые пептиды

Подвижные фазы для ХФ на сильно-кислотном сорбенте сорбент PRP-X200 (10 мкм, 200x4,6 мм) СР: 5 мМ NaH2PO4 (pH 3,0), IСР: ~0 (1 и 2), 0,1 (3), 0,5 (4) Э: 10 мМ NaH2PO4 + 6 мМ Трис (рН 7,0), IЭ: ~0 (1 и 4), 0,3 (2 и 3); 1 мл/мин

ХФ трипсинового гидролизата альбумина сорбент PRP-X200 (10 мкм, 200x4,6 мм) СР: 5 мМ NaH2PO4 (pH 3,0), IСР: 0,5 (NaCl) Э: 10 мМ NaH2PO4 + 6 мМ Трис (рН 7,0), 1 мл/мин, IЭ: ~0 Проба: гидролизат человеческого альбумина (0,1 мг) Детектирование: УФ (214 нм)

ХФ гидролизата альбумина при одновременном градиенте ионной силы сорбент PRP-X200 (10 мкм, 200x4,6 мм) СР: 3 мМ NaH2PO4 + 10% CH3CN (pH 3,0), IСР: 0,1 (NaCl) Э: 10 мМ NaH2PO4 + 6 мМ Трис + 10% CH3CN (рН 7,0), 1 мл/мин, IЭ: 0,3 (NaCl) Детектирование: УФ (214 нм)

Линейные восходящие градиенты рН в сильно-кислотных колонках активные компоненты стартового раствора и элюента – одной природы; добавки CH3CN (~10%) в обе фазы IСР (~0,1) < IЭ (~0,3) (сочетание градиента рН с градиентом ионной силы)

Выводы “Устоявшийся” метод хроматофокусирования может развиваться в следующих направлениях: 1. Предложено использовать технику хроматофокусирования и индуцирования для концентрирования и рН-градиентного разделения ионов металлов на комплексообразующих анионитах и катионитах. 2. Коммерческие “Полибуферы” можно заменить простыми одно- двухкомпонентными элюентами при создании высокой ионной силы в одной или обеих подвижных фазах. Возможности простых элюентов показаны на примере разделения металлов; аминокислот; белков; ферментов. Фокусирующий эффект для биполярных молекул усиливается за счет градиента ионной силы. 3. Технику хроматофокусирования можно использовать в сочетании с градиентом ионной силы для разделения смесей пептидов на сульфокатионитах.

Публикации Опубликовано 80 статей, из них по теме работы - 57: 2 обзора (ЖАХ, 1999; Вестник МГУ, 2005) 55 статей: ЖАХ – 9 ЖФХ – 14 Вестник МГУ – 24 Сорбционные процессы – 3 Fresenius J., Mendeleev Comm., J. Liquid Chrom., J.Chromatogr., Известия ВУЗов, Молекулярные технологии Тезисы докладов – 50: XVI, XVII, XVIII Менделеевские съезды; IICS-92, 93, 94, 2000, 2004; ICAS-97, 2006; SBS-03; Всеросс. симп. по хроматографии 1998-2008; “Разделение и концентрирование в аналитической химии”; “Ломоносовские чтения-2005”; “Аналитика России-2007” и др. Диссертации: А.В. Иванов “Хроматофокусирование переходных металлов” (1997), А.Б. Тессман “Формирование внутренних градиентов рН в ионообменной хроматографии: моделирование и экспериментальная проверка” (2000), М.С. Вакштейн ”Новые подвижные фазы для хроматофокусирования в катионообменных системах” (2006).

Благодарность докт. хим. наук П.Н.Нестеренко, О.А.Шпигуну; канд. хим. наук А.В. Гармашу; аспирантам А.Б. Тессману, М.С. Вакштейну, С.С. Кубышеву, дипл. Н.Ю. Смирновой; проф. К. Шлайсу и дипл. Т. Рейтару (Чехия) за плодотворное сотрудничество РФФИ – за финансовую поддержку исследования (проекты № 02-03-33007 и 05-03-33096)

Индуцированные градиенты в карбоксильных колонках сорбент Macro-Prep 50 CM (50x4,6 мм) Э: 8 мМ СН3СООН (pH 3,6), ионная сила: 1 и 3 - 0,1; 2 - ~0 ИР: 1 мл 3,25 М NH3 (рН 11), ионная сила: 1 - 1; 2 и 3 - ~0

Индуцированные градиенты в карбоксильных колонках сорбент Macro-Prep 50 CM (50 мкм, 50x4,6 мм) ИР: 1 мл [4 М CH3COONa + 1 M NaCl (1, 3)] (pH 11,9) Э: 5 мМ СН3СООН (pH 3,6), ионная сила (NaCl): 1, 2 – 0, 3 – 0,1 M; 1 мл/мин

Разделение ионов металлов с индуцированным градиентом рН сорбент Macro-Prep 50 CM (50 мкм, 50x4,6 мм) ИР: 1 мл (4 М CH3COONa + 1 M NaCl) (pH 11,9) Э: 5 мМ СН3СООН + 0,1 M NaCl (pH 3,6), 1 мл/мин Детектирование - УФ (254 нм): 1 - Pb2+, 2 - Co2+

Эксперимент и модель: различие в ионной силе стартового раствора и элюента (анионообменная система) IЭ > IСР 1 - сорбент Dien-SiO2 (100-160 мкм, 0,35 мМ/г) 2 - модель Tetren-SiO2 СР -25 мМ Трис-HCl (pH 7,5), Э - 5 мМ CH3COOH + NaCl (pH 3,5)

Различие в ионной силе стартового раствора и элюента IЭ < IСР сорбент Tetren-SiO2 (7,5 мкм, 1 мМ/г, 250x4,6 мм) СР: 25 мМ Трис-HCl (pH 7,5), IСР: 1 - ~0,03; 2 - 0,1; 3 - 1; 4 - 0,02 Э: 2 мМ H2C2O4 (pH 2,9), IЭ: 1, 2 и 3 - ~0; 4 - 0,5

Модельная смесь аминокислот сорбент Tetren-SiO2 (7,5 мкм, 50x4,6 мм) СР: 25 мМ Трис-HCl (pH 7,5), IСР: 0,02 Э: 2 мМ H2C2O4 (pH 2,9), IЭ: ~0; 1 мл/мин Детектирование - УФ (280 нм)

Формирование градиента рН однокомпонентными элюентами в катионообменной системе сорбент MN (5 мкм, 50x4,6 мм) СР: 10 мМ Трис-HCl (pH 7,5) Э: 1 мМ кислоты - 1 – щавелевая, 2 - винная, 3 – лимонная, 4 – глутаминовая, 5 – уксусная; 1 мл/мин

Как избавиться от подъема рН? сорбент MN (5 мкм, 50x4,6 мм) СР: 10 мМ Трис-HCl (pH 7,5) Э: 0,2 мМ лимонная кислота (pH 3,7-3,9); 1 мл/мин, ионная сила подвижных фаз: 1 - ~0; 2 - 0,01, 3 - 0,1 (NaCl)

Анионообменные сорбенты (для ХФ ионов металлов)

Карбоксильные сорбенты (для ХФ ионов металлов) Впервые – нисходящие градиенты рН

Квази-линейные градиенты рН на сорбенте с низкой емкостью сорбент MN (5 мкм, 50x4,6 мм) СР: 2 мМ лимонная к-та (pH 3,0), IСР: ~0 (1 и 2), 0,05 (3 и 4) Э: 10 мМ Трис-лимонная к-та (рН 7,0), IЭ: ~0 (1 и 3), 0,05 (2 и 4); 1 мл/мин

Влияние добавок ацетонитрила в условиях градиента рН сорбент PRP-X200 (10 мкм, 200x4,6 мм) СР: 5 мМ NaH2PO4 + 20% CH3CN (pH 3,0) Э: 10 мМ NaH2PO4 + 6 мМ Трис + 20% CH3CN (рН 7,0), 1 мл/мин Детектирование: УФ (214 нм)

Влияние ионной силы в карбоксильной колонке сорбент Macro-Prep 50 CM (50 мкм, 50x4,6 мм) СР: 2 мМ лимонная к-та + 1,5 мМ Трис (pH 3,3), Э (рН 7,6): 20 мМ Трис-HCl + 5 мМ лимонная к-та; 1 мл/мин; ионная сила: 0 (1), 0,01 (2), 0,5 (3)