Вспомогательные методы технологии рекомбинантной ДНК презентация

Вспомогательные методы технологии рекомбинантной ДНК Секвенирование ДНК Денатурация и ренатурация ДНК Гибридизация нуклеиновых кислот в растворе. Блотинг – иммобилизация нуклеиновых кислот или белков на твердой подложке Гибридизация нуклеиновых кислот на чипах

Секвенирование ДНК: методы определения последовательности фрагментов нуклеиновых кислот Общий принцип: проводят сравнение длин всех возможных концевых продуктов, полученных из исходного фрагмента таким образом, что все они имеют на одном конце одну и ту же последовательность, а на другом – один и тот же нуклеотид. Современным методом определения нуклеотидной последовательности ДНК является метод обрыва цепи (англ. chain termination method) (метод Ф. Сэнгера [F. Sanger])

Секвенирование ДНК по Сэнгеру (метод полимеразного копирования) I. Прежде всего фрагмент ДНК клонируют в фаге М13, из которого легко выделяют однонитевую ДНК. II. Ее гибридизуют с короткой ДНК, называемой праймером, которая связывается с 3'-концом однонитевой ДНК . III. Затем к полученной матрице добавляют четыре дезоксирибонуклеозидтри-фосфата дНТФ (dNTP): дАТФ (dATP), дГТФ (dGTP), дТТФ (dTTP), дЦТФ (dCTP).

Секвенирование ДНК по Сэнгеру (продолжение) IV. Кроме дНТФ (dNTP) в реакционную смесь добавляют один из четырех дидезоксирибонуклеозид-трифосфатов [ддНТФ (ddNTP)]. ддНТФ (ddNTP)] – это полученный искусственным путем нуклеотид, лишенный 2’- и 3’-гидроксильных групп при углеродных атомах рибозы

Секвенирование ДНК по Сэнгеру (продолжение) V. Затем с помощью ДНК-полимеразы ведут синтез второй (комплементарной) цепи ДНК. Остановка синтеза (обрыв цепи) будет происходить всякий раз, когда вместо dNТР в растущую цепь ДНК будет встраиваться соответствующий ему ddNТР . VI. Для определения последовательности нуклеотидов необходимо поставить 4 отдельные реакции в присутствии каждого из четырех ddNТР . Соотношение концентраций dNТР и ddNТР подбирают с таким расчетом, чтобы ddNТР оказался включенным по всем позициям в смеси растущих цепей. В результате, если в пробирке содержится ddGТР, то к концу реакции в ней оказывается набор всех возможных полинуклеотидов, начинающихся с 5’-концевого нуклеотида-праймера и заканчивающихся дидезоксигуанозином (ddGТР).

Секвенирование ДНК по Сэнгеру (продолжение) VII. Затем четыре пробы вносят в соседние лунки пластины геля и проводят гель-электрофорез . Длина пробега каждого компонента обратно пропорциональна длине цепи ДНК. VIII. Как только фрагменты ДНК визуализированы, нуклеотидную последовательность можно прочесть прямо в геле снизу по направлению к старту в соответствие с очередностью, в которой фрагменты располагаются на отдельных «дорожках».

Автоматическое секвенирование С введением в практику флуоресцентных меток достигнут серьезный прогресс в автоматизации процесса секвенирования. ФЛУОРЕСКАМИН Наиболее эффективный способ их использования - присоединение к каждому из четырех терминирующих аналогов специфической метки, отличающейся от других спектром флуоресценции. Такие модифицированные нуклеозидмонофосфаты включаются в цепь ДНК-полимеразой и выполняют сразу две функции - терминируют синтез ДНК и вводят метку в ее 3’-конец. РОДАМИН

Автоматическое секвенирование Все это значительно упростило процедуру секвенирования: ферментативную реакцию проводят в одной пробирке и, соответственно, электрофорез продуктов реакции ведут на одной дорожке. СИСТЕМА ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА CEQ8000 Специальный детектор спектра флуоресценции определяет поочередно прямо в геле природу концевого нуклеотида у разделенных продуктов и передает эту информацию в компьютер, где эта информация накапливается и обрабатывается.

2. Денатурация и ренатурация ДНК

Плавление ДНК

3. Гибридизация нуклеиновых кислот в растворе (плавление и отжиг)

4. Гибридизация нуклеиновых кислот на твердых подложках (блот-анализ) Термин блот-анализ (блотинг) применяют к процедуре иммобилизации нуклеиновых кислот или белков на твердой подложке, обычно на нейлоновых или нитроцеллюлозных мембранах. Иммобилизованные ДНК и РНК используют в последующих гибридизационных экспериментах с целью детекции специфических последовательностей. Саузерн (Southern, 1975) предложил оригинальную идею по переносу фрагментов ДНК из агарозного геля на гибридизационную мембрану

Схема Саузерн-блот гибридизации (И.Ф. Жимулев, с.165)

Блотинг по Саузерну (1975) . Гель помешают на фильтровальную бумагу, находящуюся в контакте с буфером. Мембрану накладывают на гель, а сверху укладывают несколько слоев фильтровальной бумаги, легко абсорбирующей влагу. Бумага служит своеобразным капиллярным насосом, способствуя вымыванию фрагментов ДНК током буфера из геля и переносу их на мембрану. Фиксируют ДНК на мембране (мембрану выдерживают при 80С или облучают УФ-светом) Затем мембрану помещают в раствор с меченым зондом, в котором и происходит гибридизация. После отмывки несвязавшейся радиоактивности результат выявляют с помощью радиоавтографии.

Виды блотинга Метод переноса ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозные или нейлоновые мембраны был назван по Саузерну саузерн-блотинг (southern — южный)). Метод переноса РНК из агарозного геля на нитроцеллюлозные или нейлоновые мембраны был назван нозерн-блотинг (nothern — северный). Метод переноса белков из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозные или нейлоновые мембраны (Burnette, 1981) был назван вестерн-блотинг (western — восточный). В описанных видах блотинга для организации потока ДНК, РНК и белков через гель к мембране вместо капиллярных сил используют также электрофорез и вакуум.

5. Гибридизация нуклеиновых кислот на чипах

Схема анализа последовательностей нуклеотидов с помощью ДНК-чипов

Схема переноса колоний геномной библиотеки на нитроцеллюлозный фильтр с последующей гибридизацией ДНК колоний с меченым ДНК-зондом

Создание и скрининг библиотеки генов методом гибридизации колоний с меченым зондом.