Иммунодиагностика. Методы иммунологического исследования презентация

Иммунодиагностика. Методы иммунологического исследования Кафедра КЛД ТюмГМА Д.м.н. Ананьева О.В.

Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. Изучают антитела и антигены с помощью реакций антиген-антитело, определяемых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма.

Нефелометрия определение концентрации взвешенных частиц и высоко-молекулярных веществ в растворе, основанное на оценке интенсивности рассеяния света, проходящего через этот раствор. Используется для определения концентрации антигенов, поскольку при добавлении к ним антител образуются иммунные комплексы, рассеивающие проходящий свет.

Нефелометрия позволяет с высокой точностью определить концентрацию IgG, IgA, IgM, подклассов IgG, компонентов С3, С4, фактора В системы комплемента, С-реактивного белка и некоторых других сывороточных белков. Этот метод подходит для определения белков в низкой концентрации, например IgE, уровень которого в сыворотке не превышает 1 мкг/мл. В настоящее время многие лаборатории используют нефелометрию в качестве стандартного метода количественного определения иммуноглобулинов.

Иммуноферментный анализ (ИФА – выявление антигенов или антител с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат / хромоген (субстрат для пероксидазы – перекись водорода, а хромоген – тетраметилбензидин, 5-аминосалициловая кислота, орто-фенилендиамин и др.). Субстрат расщепляется ферментом, что в конечном итоге приводит к изменению цвета продукта реакции: интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. Реакцию останавливают добавлением раствора серной кислоты.

ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекции, гепатитов В и С и др., а также для определения гормонов, ферментов, цитокинов, иммуноглобулинов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в малых концентрациях (10­¹º - 10­¹² г/л).

Иммуноблоттинг (или вестернблоттинг) – высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА. ИБ используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.

Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их (блоттинг- от англ. blot – пятно) из геля на активированную бумагу (1) или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА.

Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов*. На эти полоски (стрипы) наносят сыворотку больного (2). Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом (3).

Образовавшийся на полоске комплекс (антиген + антитело больного + антитело против Ig человека) выявляют добавлением хромогенного субстрата (4), изменяющего окраску под воздействием фермента.

Иммуноблоттинг

* Метод переноса пятен ДНК первоначально разработал в 1975 г. Саузерн (фамилия Southern в переводе означает «южный»); метод получил название саузернблоттинг (южный перенос). Метод переноса фрагментов РНК назвали нозернблоттинг (северный перенос), а метод переноса фрагментов белка – вестернблоттинг (западный перенос).

Проточная цитометрия. Клетки крови можно дифференцировать на основе лазерной цитофлюорометрии. Искомые клетки, точнее их маркеры – CD-антигены, окрашивают флюоресцирующими антителами. Для окрашивания клеток (например, CD4+, CD8+-Т-лимфоцитов) применяют моноклональные антитела против их CD-антигенов, меченные флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТС), дающим зеленую флюоресценцию, или фикоэритрином, дающим красное свечение.

Образец крови после обработки меченными моноклональными антителами пропускают через тонкую трубку. Через исследуемый образец пропускают лазерный луч, который возбуждает свечение флюорохрома.

Фотоумножитель улавливает светорассеивание, по которому анализируется размер, гранулярность клетки, и регистрирует флюоресценцию, свидетельствующую о количестве меченых антител, связанных с клеткой. Интенсивность флюоресценции коррелирует с плотностью антигенов на поверхности клеток и может быть количественно измерена с помощью фотоэлемента. Полученные результаты преобразуются в гистограмму.

Рис.31. Принцип проточной цитометрии

Рис.32. Проточная цитометрия (гистограмма)

Проточную цитометрию применяют для определения содержания основных популяций лимфоцитов, внутриклеточных и внеклеточных цитокинов, функциональной активности NK-клеток, активности фагоцитоза, особенностей апоптоза, диагностики гемобластозов и др.

Функциональные тесты. 1. Спонтанная реакция бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) – способность лимфоцитов к трансформации без стимуляции ( в норме – до 10%), выполняется для оценки функциональной активности Т-лимфоцитов.

2.Стимулированная бластная трансформация с митогенами фитогемагглютинином (ФГА) или конканавалином (Кон А) характеризует функциональную способность Т-лимфоцитов к трансформации и размножению под воздействием антигенов, аллергенов и митогенов.

О функциональной активности В-лимфоцитов судят по бластной трансформации в ответ на стимуляцию митогеном лаканоса и другими липополисахаридными митогенами, а на стимуляцию митогеном латекса – о кооперативных процессах между Т- и В-лимфоцитами. Пролиферативный ответ лимфоцитов на антигены дает представление о выраженности специфической сенсибилизации организма. В норме – 40-75%.

Заболевания и состояния, при которых изменяется спонтанная бластная трансформация лимфоцитов

Фагоцитарная активность нейтрофилов. Изучение показателей фагоцитоза имеет значение в комплексном анализе и диагностике иммунодефицитных состояний: часто рецидивирующих гнойно-воспалительных процессов, длительно не заживающих ран, склонности к послеоперационным осложнениям.

Наиболее информативными для оценки активности фагоцитоза считают: Фагоцитарное число (ФЧ) – среднее количество микробных или дрожжевых частиц, поглощенных одним нейтрофилом крови. Характеризует поглотительную способность нейтрофилов. Норма – 5-10 микробных частиц, 1-3 дрожжевых. Фагоцитарная показатель (ФП) – процент нейтрофилов, имеющих поглощенные частицы от общего числа. Норма для взрослых – 65-95% (микробные ч.), 65-85% (дрожжи) Индекс завершенности фагоцитоза –переваривающая способность фагоцитов. Норма - больше или равно 1.0

Заболевания и состояния, при которых изменяется фагоцитарная активность нейтрофилов

НСТ-тест в крови. Спонтанный тест с НСТ (нитросиний тетразолий) позволяет оценить степень антигенной раздраженности неактивированных in vitro гранулоцитов крови. Он характеризует степень активации внутриклеточных антибактериальных систем. Принцип метода основан на восстановлении поглощенного фагоцитом растворимого красителя нитросинего тетразолия в нерастворимый диформазан под влиянием супероксиданиона, образующегося в НАДФ-Н-оксидазной реакции.

Повышение спонтанного теста с НСТ отмечается при антигеном раздражении вследствие бактериального воспаления (продромальный период, период острого проявления инфекции при нормальной активности фагоцитоза), при хроническом гранулематозе, лейкоцитозе, усилении антителозависимой цитотоксичности фагоцитов, аутоиммунных заболеваниях, аллергии.

Снижение спонтанного теста с НСТ характерно для хронизации воспалительного процесса, врожденных дефектов фагоцитарной системы, вторичных и первичных иммунодефицитов, СПИДа, злокачественных новообразований, тяжелых ожогов, травм, стрессов, недостаточности питания, лечения цитостатиками и иммунодепрессантами, облучения ионизирующей радиацией. В норме у взрослых число НСТ-положительных нейтрофилов в спонтанном тесте – до 10%.

Активированный тест с НСТ в крови позволяет оценить функциональный резерв кислородзависимого механизма бактерицидности фагоцитов. При сохраненной внутриклеточной антибактериальной активности в фагоцитах резко возрастает число формазанположительных нейтрофилов после их стимуляции латексом или пирогеналом. Снижение показателей активированного НСТ-теста нейтрофилов ниже 40% и моноцитов ниже 87% свидетельствует о недостаточности фагоцитоза. В норме у взрослых число НСТ-положительных нейтрофилов в активированном тесте – 40 - 80%.

Определение уровня ЦИК в сыворотке. Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) – это комплексы, состоящие из антигена, антител и связанных с ними компонентов комплемента С3, С4, С1q. В норме иммунные комплексы, образовавшиеся в кровотоке , фагоцитируются и разрушаются как фагоцитами, так и печенью. Однако при увеличении их размера (при избытке антигена и наличии в их структуре IgM, C1q-компонента комплемента) комплексы могут откладываться в периваскулярном пространстве и корковом слое почек, вызывая активацию комплемента и воспалительные процессы.

Патологические реакции на иммунные комплексы могут быть обусловлены повышением скорости их образования над скоростью элиминации, дефицитом одного или нескольких компонентов комплемента или функциональными дефектами фагоцитарной системы. Определение уровня иммунных комплексов в сыворотке крови имеет важное значение в диагностике острых воспалительных процессов и аллергических реакций III типа, при которых уровень ЦИК повышается, а также в оценке эффективности проводимого лечения.

Принцип метода определения уровня ЦИК в сыворотке основан на изменении величины светового рассеивания раствора полиэтиленгликоля вследствие осаждения им ЦИК из сыворотки крови. Изменение плотности раствора регистрируется на спектрофотометре при длине волны 280 нм. Различные концентрации ПЭГ вызывают преципитацию различных по молекулярной массе и размерам иммунных комплексов. Низкие концентрации ПЭГ осаждают комплексы крупных размеров, высокие вызывают преципитацию низкомолекулярных соединений Нормальные величины ЦИК: с 3,5% р-ром ПЭГ - 0 – 40; с 5% р-ром – 30 – 80; с 7% р-ром – 80 – 300 ед. опт. плотности.

Основным принципом оценки результатов комплексного исследования иммунного статуса у больного является количественное и функциональное определение всех его звеньев – гуморального, клеточного и неспецифической резистентности – и их сравнение с нормальными величинами. Используя методы клинической иммунологии, необходимо выявить у больного уровень нарушений, а затем осуществлять контроль за восстановлением иммунного статуса организма в процессе лечения.

Спасибо за внимание!

Антигены HLA класса I необходимы для распознавания трансформированных клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами. Функция антигенов HLA класса II - обеспечение взаимодействия между Т-лимфоцитами и макрофагами в процессе иммунного ответа. Т-хелперы распознают чужеродный антиген лишь после его переработки макрофагами, соединения с антигенами HLA класса II и появления этого комплекса на поверхности макрофага.

Способность Т-лимфоцитов распознавать чужеродные антигены только в комплексе с антигенами HLA называют ограничением по HLA. Определение антигенов HLA классов I и II имеет большое значение в клинической иммунологии и используется, например, при подборе пар донор – реципиент перед трансплантацией органов.

Механизмы иммунитета Иммунный ответ происходит в результате взаимодействия дендритных клеток, макрофагов, цитокинов, Т- и В-лимфоцитов (клетки взаимодействуют при межклеточном контакте мембранами с помощью молекул межклеточной адгезии и с помощью цитокинов). Он включает 4 фазы: распознавание антигена, активация, пролиферация и дифференцировка клеток.

Гуморальный иммунный ответ (антителообразовние Основой гуморального (от лат. humor – жидкость) иммунного ответа является активация В- лимфоцитов и их дифференцировка в антителообразующие плазматические клетки – плазмоциты. В–лимфоцит играет роль антигенраспознающей, антигенпрезентирующей клетки и антиелообразующей клетки.

Гуморальный иммунный ответ (антителообразовние Иммуноглобулиновый рецептор В-лимфоцитов (ВСR) распознает антиген, и клетка поглощает его. После процессинга (расщепления поглощенного антигена до низкомолекулярных пептидов и встраивания их в HLA II класса) В-лимфоциты представляют образовавшийся комплекс Тh2-хелперам, которые взаимодействуют с ним рецептором ТСR и корецептором СD4. Происходит активация и пролиферация В-лимфоцитов. Размножаясь в геометрической прогрессии (7-9 делений), В-клетка формирует клон плазматических клеток.

Гуморальный иммунный ответ (антителообразовние Начинается активный синтез иммуноглобулинов. Плазматические клетки в основном все уходят в к.м., и там продуцируют до 30 000 молекул Ig в мин. Первые АТ появляются в крови на 5-е сутки (от момента проникновения патогена) класса IgM (можно диагностировать о фазу инфекции) Max. синтез IgM – на 14 день К концу месяца – уровень ↓ до нормы

Гуморальный иммунный ответ (антителообразовние Когда Тh2-хелперы начинают секретировать ИЛ-6, происходит переключение иммуноглобулиновых генов В-лимфоцитов на синтез IgG (на 7-е сутки). По соотношению IgM и IgG можно определить стадию болези: Острая - + IgM Подострая - +IgM и IgG Затяжное, хрон. течение, ремиссия - +IgG Max. синтез IgG – на 30 день Срок жизни – до 60 дней

Гуморальный иммунный ответ (антителообразовние Клетки памяти формируются после 30 дня заболевания. У взрослых ~ 85% лимфоцитов – клетки памяти. Клеток памяти нет до встречи с антигеном. Формирование клеток памяти – главное в иммунном ответе.

Клеточный иммунный ответ. Участвуют популяции Тh1-хелперов CD4+ и цитотоксических Т-лимфоцитов CD8+ (ЦТЛ). АПК (макрофаги и дендритные клетки) после процессинга поглощенного антигена представляют ЦТЛ микробные пептиды в комплексе с МНС І класса. ЦТЛ с помощью антигенраспознающего рецептора (ТСR) и его корецептора CD8 распознают соответственно микробный пептид и МНС І класса (двойное распознавание).

Клеточный иммунный ответ. Активированные дифференцированные ЦТЛ вызывают гибель клеток-мишеней с участием перфорина, гранзимов, гранулизинов, Fas-рецепторов и ФНО.

Клеточный иммунный ответ. Разновидностью клеточного иммунного ответа является гиперчувствительность замедленного типа с участием Тh1-хелперов CD4+ и активированных макрофагов. Тh1-хелперы CD4+ распознают на поверхности длительно инфицированных макрофагов микробные пептиды в комплексе с МНС II класса и выделяют IF-y. Происходит активация макрофагов и гибель внутриклеточных микробов.

Противобактериальный иммунитет. Основа – фагоцитоз, затем – клеточный и гуморальный.

Противовирусный иммунитет. Основа – клеточный, затем гуморальный, факторы врожденного иммунитета (сывороточные противовирусные ингибиторы) и фагоцитоз.

Противоопухолевый иммунитет основан на Тh1-зависимом клеточном иммунном ответе, активирующем цитотоксические Т-лимфоциты, макрофаги, дендритные клетки, NK-, T-NK-клетки. Роль гуморального (антительного) невелика.

Противоопухолевый иммунитет Антигены опухоли слабо иммуногенны. Антитела, соединяясь с антигенными детерминантами на опухолевых клетках, экранируют их от цитопатогенного действия иммунных лимфоцитов. Механизм презентации антигена часто нарушается, нет достаточного уровня ФНО, интерферонов, ИЛ-2 и др. цитокинов. Опухоли запускают феномен «ускользания» от иммунитета. Уменьшение экспрессии МНС на опухолевых клетках ведет к отмене распознавания опухоли. Неспецифические факторы, повреждающие опухолевые клетки: 1) NK-клетки, система мононуклеарных фагоцитов, противоопухолевая активность которых усиливается под действием ИЛ-2 и ИФН-α, -β; 2) цитокины (ИФН-α, -β, ФНО-α и ИЛ-2).

Лабораторные показатели для оценки иммунного статуса Иммунный статус – состояние иммунной системы человека, оцениваемое комплексом качественных и количественных клинико-лабораторных показателей. Гематологические показатели: 1. Количество лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, гемоглобина, гемоглобина в эритроците и в эритроцитах; цветовой показатель. 2. Процентное содержание нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов, базофилов. 3. Показатели СОЭ.

Оценка Т-клеточной системы иммунитета (клеточного иммунитета): 1. Определение общего числа лимфоцитов. 2. Определение числа зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) и их субпопуляций – хелперов (CD4+) и цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+). 3. Определение соотношения CD4+\CD8+ (иммунорегуляторный индекс). 4. Определение реакции Т-лимфоцитов на активацию фитогемагглютинином (Т-митоген) в реакции бластной трансформации (РБТЛ). 5. Постановка кожных проб ГЗТ. 6. Дополнительные уточняющие методы: • определение маркера ранней активации CD25 (рецептор для ИЛ-2) и HLA-DR на Т-лимфоцитах; • исследование продукции цитокинов (ИФН-γ, ИЛ-2, -4, -6, ФНО); определение пролиферативного ответа на специфический антиген в РБТЛ; • определение готовности Т-лимфоцитов к апоптозу (определение апоптозного антигена Fas – CD95).

Оценка В-клеточной системы иммунитета (гуморального иммунитета): 1. Определения числа В-лимфоцитов (CD19+ или CD20+). 2. Определение количества неспецифических иммуноглобулинов (ІgA, IgM, IgG, IgE). 3. Определение циркулирующих в крови иммунных комплексов. 4. Определение функциональной активности лимфоцитов с помощью РБТЛ на В-клеточный митоген. 5. Дополнительные уточняющие методы: •определение количества специфических иммуноглобулинов (ІgA, IgM, IgG, IgE); • определение продукции ИЛ-6; • определение секреторного ІgA.

Показатели системы комплемента: Определение компонентов комплемента (С1q, С1, С3, С4, С5 и др.) в сыворотке крови. Система фагоцитов (нейтрофилов): 1. Определение числа нейтрофилов. 2. Определение индекса фагоцитоза (процент клеток, участвующий в фагоцитозе) и фагоцитарного числа (число микробов или др. частиц, захваченных одной клеткой). Определение индекса завершенности фагоцитоза. 3. Определение бактерицидности фагоцитов (по НСТ-тесту и др.). 4. Дополнительные уточняющие методы: •определение активности хемотаксиса фагоцитов; • определение способности нейтрофилов к адгезии к пластику и наличия клеток с адгезивными молекулами CD11\ CD18.

Оценка функциональной активности лимфоцитов: (пролиферативный ответ на Т- и В-митогены, цитотоксическая активность NK-клеток. Оценка цитокинового профиля: Определение ИЛ-1, -2, -4, -6 и др. Оценка интерферонового профиля: Определение ИФН-α и ИФН-γ.

Нормативные значения некоторых лабораторных показателей иммунного статуса человека в различные возрастные периоды (Проф. Н.М. Калинина, г. С-Петербург Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины)

Спасибо за внимание