Проведення полімеразної ланцюгової реакції з використанням діагностичних тест-систем презентация

Денатурація (94°C): Розділення ниток матриці ДНК; Гібридизація (відпал) праймерів на матриці (40-65°C): Праймери є затравками для подальшого синтезу за участі ДНК-полімераз; Синтез комплементарних ланцюгів (72°C).

Ампліфікація необхідного фрагмента ДНК відбувається між двома праймерами (праймери входять до складу ПЛР-продукту); Ампліфікацію проводят протягом 30-40 циклів (для клонування – бажано не більше 28 циклів): Кожний цикл складається з трьох основних температурних режимів (але може бути і два, наприклад - 94 °C і 67 °C); В реакції використовують термостабільні ДНК-полімерази; За 30 циклів відбувається збільшення копій заданого фрагмента ДНК в 1 000 000 000 разів; Кінетика накопичення продукту ПЛР-реакції характеризується виходом на «плато».

Виснаження субстратів (дНТФ і праймерів); Виснаження субстратів (дНТФ і праймерів); Зниження активності полімерази; Накопичення інгібіторів полімерази (пірофосфатів і ДНК-дуплексів); Неповна денатурація ДНК при високій концентрації продуктів ПЛР.

Довжина праймерів 18-30 нуклеотидів (за виключенням праймерів для клонування); GC-склад 40-60%, близький до GC-складу матриці (виключення-праймери для клонування); Різниця в температурах відпалу не більше 5оС; Не можуть утворювати шпильок на 3’-кінці: Не можуть утворювати димерів за 3’-кінцями: Бажано, щоб на 3’-кінці був або гуаніновий, або цитидиновий нуклеотид.

Якщо використовуються праймери з наукових статей – часто необхідно оптимізувати умови ПЛР під наявні прилади і реактиви!!! Якщо використовуються праймери з наукових статей – часто необхідно оптимізувати умови ПЛР під наявні прилади і реактиви!!! Існують т.з. ,,універсальні” праймери – їх можна знайти у відповідних базах даних, зокрема PubMed:

Температурний профіль реакції; Температурний профіль реакції; Тривалість окремих етапів реакції (в окремих випадках – збільшення тривалості відпалу і синтезу до 2 хвилин); Склад реакційної суміші: концентрація іонів магнію; концентрація праймерів; концентрація полімерази; додаткові сполуки (гліцерол, ДМСО, формамід, БСА та ін.); Робота з матрицею ДНК (переосадження (додаткова очистка), розведення, концентрування, вирізання з агарози фрагментів тощо); Використання інших праймерів; Проведення Nested (вкладеної) ПЛР;

За допомогою інтеркалюючих барвників (SYBR Green тощо); За допомогою інтеркалюючих барвників (SYBR Green тощо); За допомогою гібридизаційних зондів (проби Taqman); За допомогою праймерів мічених флюоресцентними мітками Fam, Hex, Cy5, Rox тощо.

ПЛР з «гарячим» стартом (hot-start PCR); ПЛР з «гарячим» стартом (hot-start PCR); Touchdown ПЛР; Мультиплексна ПЛР; Гніздова, або вкладена (nested) ПЛР; ПЛР з оберненою транскрипцією (Reverse transcriptіоn PCR (RT-PCR)); ТОЩО

ПЛР з «гарячим» стартом (hot-start PCR) (ПІДВИЩУЄ СПЕЦИФІЧНІСТЬ РЕАКЦІЇ): ПЛР з «гарячим» стартом (hot-start PCR) (ПІДВИЩУЄ СПЕЦИФІЧНІСТЬ РЕАКЦІЇ): Внесення полімерази після попередньої денатурації; Або: активація інактивованої білками полімерази попереднім тривалим (10-15 хв) підвищенням температури; Або: використання плавких розділювачів між полімеразою і матрицею. Touchdown ПЛР (зниження температури відпалу у кожному циклі, збільшення тривалості відпалу на кожному циклі, інколи – зменшення температури синтезу в циклах ПЛР);

Контамінація; Контамінація; Организація лабораторії (робочих місць) за принципом ізольованих робочих зон; Розділене використання обладнання при роботі з чистими розчинами і розчинами, які містять ДНК або ПЛР-продукти; Обов’язкова постановка в кожному експерименті негативного і позитивного контролів; Стокові розчини розділяти на аліквоти і періодично змінювати; ПЛР-продукти зберігати в окремому холодильнику від реактивів.